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.2017年1月17日；114（3）：E307-E316。
doi:10.1073/pnas.1612730114。 Epub 2017年1月4日。

SNX-1和RME-8反对HGRS-1/ESCRT-0降解微结构域在内切体上的组装

安妮·诺里斯 1, 普拉萨德·塔米尼尼 2, 分析师王骁敏 1, 朱莉安·格德斯 1, 亚历山德拉·穆尔 1, 凯文·关颖珊 三, 钱财 2, 巴特·德·格兰特 4
附属公司

SNX-1和RME-8反对HGRS-1/ESCRT-0降解微结构域在内切体上的组装

安妮·诺里斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

在内吞作用后，跨膜货物到达内体，在那里它遇到致力于相反功能的复合物：再循环和降解。含有转运（ESCRT）-0组分Hrs（秀丽隐杆线虫中肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HGRS-1）所需的内体分选复合物的微域介导货物降解，浓缩泛素化货物并组织ESCRT的活性。同时，逆转录酶相关分选连接蛋白1（SNX-1）及其结合伙伴J域蛋白RME-8将货物从降解中分离出来，促进货物再循环至高尔基体。因此，我们假设逆转录酶和ESCRT之间可能存在重要的调节相互作用，以平衡降解和再循环功能。利用秀丽线虫体腔细胞的天然大内体，我们在体内观察到互补的ESCRT-0和RME-8/SNX-1微域，并分析了逆转录酶和ESCRT微域相互调节的能力。我们发现在snx-1（0）和rme-8（ts）突变体中，HGRS-1标记的微结构域的内体覆盖率和强度增加，与膜结合的HGRS-1总水平增加。这些效应是SNX-1和RME-8特有的，因为其他逆转录体成分SNX-3和空泡蛋白分选相关蛋白35（VPS-35）的丢失不会影响HGRS-1微结构域。此外，hgrs-1的敲除对SNX-1和RME-8微结构域几乎没有影响，这表明相互作用具有方向性。在没有RME-8和SNX-1的情况下，功能不同的ESCRT-0和SNX-1/RME-8微结构域的分离也受到影响，我们观察到这一现象是保守的，因为HeLa细胞中Snx1和Snx2的缺失也导致内体上RME-8和Hrs的更大重叠。

关键词：高分辨率分光计；RME-8；SNX-1；网格蛋白；内体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
SNX-1和RME-8对于秀丽线虫体腔细胞。在野生型中可见体腔细胞中表达的MIG-14:：GFP，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)突变背景。MIG-14标记内体、内点和质膜。请注意，在插入(A类–A类′′). 由GFP、人CD4-GFP细胞外结构域的一部分以及人CIMPR的细胞质和跨膜结构域组成的杂交模型逆转录酶货物的荧光显微照片，在野生型中表达，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)体腔细胞突变。hCIMPR-CD4-GFP标记内体、内点，在较小程度上标记体腔细胞质膜。请注意，在插入(B类–B类′′).秀丽线虫TGN38/46同源物TGN-38:：GFP在野生型体腔细胞中表达，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)突变体。TGN-38:：GFP对内体的标记不均匀，对内点的标记强烈，对质膜的标记较弱(C类–C类′′). （比例尺：5µm）在相同的图像采集条件下，野生型与突变型背景下每种货物的平均强度的量化(D类和E类). MIG-14、hCIMPR和TGN-38与高尔基体标记AMAN-2共表达。Puncta（小箭头）与高尔基体标记AMAN-2:：RFP共定位（大箭头表示高尔基体与货物标记的内体相邻）(F类–H（H）′′). (我)三种货物结构的图示。所有实验均在25°C下进行。
图S1。
图S1。
hCI-MPR标签野生型高尔基(A类和A类“”）和snx-1型(tm847（tm847）) (B类和B类''）突变体。大箭头表示内胚局部的hCI-MPR，在snx-1型(tm847（tm847）)突变体。小箭头表示hCI-MPR与高尔基体标记AMAN-2共定位，该标记存在于野生型和snx-1（tm847)突变体。图1中的TGN-38 GFP面板C类以较低比例表示，以显示捕获TGN-38的形态结构rme-8型(1023吨)和snx-1型(tm847（tm847）)突变体(C类–C类′′). MIG-14-GFP水平在snx-1型(tm847（tm847）)HGRS-1缺失突变体。表达MIG-14 GFP野生型的体腔细胞(D类和D类'）或snx-1型(tm847（tm847）) (E类和E类′）用载体处理后(D类和E类)或HGRS-1 RNAi(D类'和E类′). (F类)MIG-14 GFP水平的量化D类–E类′. （比例尺：5µm）
图2。
图2。
逆转录酶相关蛋白RME-8和SNX-1特异性标记与ESCRT-0蛋白HGRS-1互补的内体微结构域。图片显示了表达柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的完整活动物体内的体腔细胞，这些细胞被允许从体腔摄取Cy5-BSA 10分钟(A类–A类′′). 显示一个内体周围像素强度的线扫描（如A〃所示，插入)显示HGRS-1和SNX-1在Cy5-BSA填充的内体上的互补定位(A类′′′). 柠檬酸：：RME-8和tagRFP:：HGRS-1标记不同的微域(B类–B类′′). 内体限制膜的线扫描(B类′′,插入)表示HGRS-1和RME-8的互补本地化(B类′′′). 用GFP标记的内源性VPS-35微域与柠檬酸不同：：HGRS-1(C类–C类′′). 内体行扫描C类′′,插入(C类′′′). Citrine:：HGRS-1和CLIC-1:：tagRFP在内体上的离散微结构域中共定位(D类–D类′′). 内体行扫描D类′′,插入(D类′′′). （比例尺：5µm）相关线扫描右侧内胚体成分定位的图示(E类). (F类)内体成分共定位的量化A类–D类.
图3。
图3。
HGRS-1和SNX-1微区在相关货物中富集。(A类–A类′′）MIG-14:：tagRFP（伪绿色）沿内胚体外围的强度峰值与GFP:：SNX-1（伪红色）一致。(A类〃′）内吞体周围的双色线扫描(A类′′,插入). (B类–B类′′）MIG-14:：GFP和tagRFP:：HGRS-1显示互补微区富集。(B类〃′）内吞体周围的双色线扫描(B类′′,插入). (C类–C类摄入5分钟后，Cy3-BSA富含柠檬酸：HGRS-1标记的微域。(C类〃′）内吞体周围的双色线扫描(C类′′,插入). （比例尺：5µm）(D类)面板的图示显示在右侧。(E类)相关货物和内体成分共同定位的量化A类–C类.
图4。
图4。
HGRS-1内体占位由SNX-1、SNX-6和RME-8控制。(A类–A类''和B类–B类′′）在野生型和snx-1型突变背景。野生型和snx-1型突变株(C类). 裂解和超速离心后，通过Western blot测定内源性HGRS-1的膜结合，以从野生型细胞液中分离膜，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)突变菌株。分数显示在车道上方。在每条车道上装载等效样本。100P与上清液的比率和18P与上清的比率显示在这两个部分下面。在rme-8型和snx-1型突变体中，18P和100P组分比野生型含有更多的HGRS-1。RME-2是一种跨膜卵黄受体，仅与膜组分分离(D类). (E类–K（K）)黄嘌呤：HGRS-1野生型图像，snx-1型(tm847（tm847）),snx-6型(tm3790型),rme-8型(第1023页),snx-3型(tm1595型)、和vps-35版(胡68)在25°C下具有相同暴露和缩放条件的突变菌株。(L（左）)野生型和突变背景中黄嘌呤的定量：HGRS-1强度。（比例尺：5µm）
图S2。
图S2。
HGRS-1强度不受SNX-1或RME-8过度表达的影响，总蛋白水平在snx-1型和snx-3型突变体。仅表达柠檬酸：：HGRS-1的体腔细胞(A类)或在SNX-1:：tagRFP或tagRFP:：RME-8在场的情况下(B类和C类). (D类)柠檬酸水平：HGRS-1来自A类–C类量化。野生型RME-8与柠檬酸和tagRFP标记的转基因的水平测量。肌动蛋白被用作加载控件(E类). 野生型表达GFP:HGRS-1的动物，snx-1型、和snx-3型对突变体进行裂解，在SDS/PAGE上运行，并探测GFP。肌动蛋白被用作加载控件(F类). (G公司)量化F类（比例尺：5µm）
图S3。
图S3。
HGRS-1对限制RME-8或SNX-1内体结构域并不重要。用空载体RNAi对照处理表达GFP:：SNX-1的菌株(A类)或hgrs-1型RNA干扰(A类′). 表达GFP:：RME-8的菌株经空载体RNAi对照处理(B类)或hgrs-1型RNA干扰(B类′). 用空载体RNAi对照处理表达GFP:：HGRS-1的菌株(C类)或hgrs-1型RNA干扰(C类′). 在对照组和对照组中定量了GFP:：SNX-1、GFP:。hgrs-1型RNA干扰(D类). （比例尺：5μm）
图5。
图5。
RME-8和SNX-1控制微区分离。表达柠檬碱：：HGRS-1和tagRFP:：RME-8的菌株显示互补微域(A类–A类′′′). (B类–B类′′′)snx-1型(tm847（tm847）)表达柠檬碱：：HGRS-1和tagRFP:：RME-8的突变体显示出正常分离域的重叠增加。(C类–C类“”“）表达tagRFP:：HGRS-1（假绿色）和GFP:：RME-8（DNAJ-HPD-AAA）（假红色）的体腔细胞显示正常分离区域的重叠增加，以及内体成分HGRS-1和RME-8的形态学改变。(D类–D类“”）野生型体腔细胞中的柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1显示互补的微域定位。(E类–E类′′′)rme-8型(第1023页)表达柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的突变体腔细胞在温度变化后18小时显示出正常分离区域的重叠增加。(F类–F类“”）在温度变化后30小时，内体不再可识别，柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1显示正常分离结构域的重叠增加。(G公司–G公司“”）表达柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的菌株snx-3型(tm1595型)蠕虫显示野生型互补定位。(H（H）)内胚体微结构域的重叠被量化。(我)左侧面板内体微域定位的图示。（比例尺：5µm）
图S4。
图S4。
当体腔细胞中没有RME-8时，网格蛋白会积聚，网格蛋白的丢失会破坏微区分离。表达柠檬碱：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的菌株显示互补微域(A类–A类′′′).甲烷-1(1025吨)表达黄嘌呤：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的突变体在夜间转移到非允许温度，显示出正常分离域的重叠增加(B类–B类′′′). 黄嘌呤：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1重叠的量化甲烷-1(1025吨)突变背景(C类). 氯菊酯轻链（Clic-1）：：tagRFP以野生型和rme-8型(第1023页)具有相同暴露和缩放条件的突变菌株在指定时间内转移到25°C(D类–D类′′). 野生型和突变背景中CLIC-1:：tagRFP的量化(E类). （比例尺：5µm）
图6。
图6。
SNX-1在HeLa细胞微区分离中的作用是保守的。内源性Hrs和RME-8的共焦显微镜显示，在对照细胞的核周区域存在肩对肩定位。箭头表示Hrs和RME-8免疫染色并列(A类–A类′′′). 在SNX1/2 siRNA条件下，RME-8和Hrs标记的结构域在核周区的放大结构中共存。箭头表示扩大的内体对共定位RME-8和Hrs呈阳性(B类–B类′′′). d风暴(C类′–H（H）′）与外荧光(C类–H（H）)用对照干扰siRNA转染内源性Hrs和RME-8的图像(C类–E类和C类′–E类′）和SNX1/2 siRNA(F类–H（H）和F类′–H（H）′). 箭头表示RME-8和小时，它们是接近的和/或同位的。SNX1/2 siRNA显著增加了Hrs和RME-8相互作用的最近邻分析强度(我). 线扫描的量化如所示E类′ (J型)和H（H）′ (K（K）).
图S5。
图S5。
针对Snx1或Snx2探针的HeLa细胞裂解物的Western blot表明有效的敲除。
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