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.2016年9月22日；167（1）：233-247.e17。
doi:10.1016/j.cell.2016.08.056。

编辑哺乳动物基因组中的DNA甲基化

X肖恩·刘 1, 郝武 1, 熊基 1, 约纳坦·斯特泽尔 1, 吴学兵 1, Szymon Czauderna公司 2, 健舒 1, 丹尼尔·达顿 三, 理查德·A·杨 三, 鲁道夫·杰尼什 4
附属公司

编辑哺乳动物基因组中的DNA甲基化

X肖恩·刘等。 单元格. .

摘要

哺乳动物DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，在许多生物过程中协调基因表达网络。然而，对特定甲基化事件功能的研究仍然具有挑战性。在这里，我们证明Tet1或Dnmt3a与催化失活的Cas9（dCas9）的融合能够实现靶向DNA甲基化编辑。将dCas9-Tet1或-Dnmt3a融合蛋白靶向甲基化或非甲基化启动子序列分别导致内源性报告子的激活或沉默。通过dCas9-Tet1诱导有丝分裂后神经元中的BDNF表达或激活的MyoD促进成纤维细胞重编程为成肌细胞，靶向去甲基化BDNF启动子IV或MyoD远端增强子。dCas9-Dnmt3a靶向CTCF环锚定位点的从头甲基化阻断了CTCF结合并干扰DNA环，导致相邻环中的基因表达改变。最后，我们表明这些工具可以编辑小鼠的DNA甲基化，证明了它们在表观遗传调控的功能研究中的广泛用途。

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数字

图1
图1
dCas9-Tet1激活Dazl-Srrpn-GFP报告子。（A） 上面板：催化非活性突变体Cas9（dCas9）的示意图，与Tet1融合以消除DNA甲基化，与Dnmt3a融合以消除从头开始特定序列的甲基化。下面板：一个优化的dCas9效应器构建和一个带有紫色和樱桃磁带。（B） 目标的示意图Snarpn公司启动子区由dCas9-Tet1和特异性gRNAs清除甲基化并激活GFP表达。（C） 用表达dCas9-Tet1（dC-T）的慢病毒感染Dazl-Srrpn-GFP mESCs，慢病毒带有一个打乱的gRNA（sc gRNA）或4 gRNA靶向Snarpn公司启动子区（靶gRNA）。感染后3天通过流式细胞仪分析计算这些细胞的GFP阳性细胞百分比，显示为两个生物复制品的GFP阴性细胞±SD的平均百分比。请注意，GFP阳性细胞的百分比表示为受感染的樱桃阳性细胞的分数。（D） 左，培养1周后C中分类樱桃阳性细胞的代表性荧光图像。比例尺：250 um。右，量化GFP阳性菌落的百分比，显示为两个生物复制品的GFP阳性细胞±SD的平均百分比。（E） 细胞的亚硫酸氢盐测序如C.（F）中所述Snrpn公司启动子区及其邻近区域达兹尔轨迹。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。另请参见图S1和S2。
图2
图2
dCas9-Dnmt3a沉默Gapdh-Snrpn-GFP报告基因。（A） 目标的示意图Snarpn公司启动子区由dCas9-Dnmt3a与特定gRNAs甲基化启动子并沉默GFP表达。（B） Gapdh-Srrpn-GFP mESCs被表达dCas9-Dnmt3a（dC-D）的慢病毒感染，慢病毒带有一个打乱的gRNA（sc gRNA）或靶向Snarpn公司启动子区（靶gRNA）。感染后3天通过流式细胞仪分析计算GFP阴性细胞的百分比，显示为两个生物复制品的GFP阳性细胞±SD的平均百分比。请注意，GFP阳性细胞的百分比表示为受感染的樱桃阳性细胞的分数。（C） 左，培养1周后B中分类的樱桃阳性细胞的代表性荧光图像。比例尺：250 um。对，GFP阴性菌落的百分比进行了量化，显示为两个生物复制品的GFP阴性细胞±SD的平均百分比。（D） B（E）中描述的细胞亚硫酸氢盐测序Snarpn公司启动子区及其邻近区域Gapdh公司轨迹。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。（F） Gapdh-Srrpn-GFP mESCs与多西环素诱导的dCas9-Dnmt3a被表达gRNAs的慢病毒感染Snarpn公司多西环素（2 ug/ml）存在下的启动子区域。感染后3天通过流式细胞仪分析计算GFP阴性细胞的百分比，显示为两个生物复制品的GFP阳性细胞±SD的平均百分比。请注意，GFP阳性细胞的百分比表示为受感染的樱桃阳性细胞的分数。（G） 左侧，F中分类的樱桃阳性菌群在使用或不使用多西环素培养1周后的代表性荧光图像。比例尺：250 um。对，GFP阴性菌落的百分比进行了量化，显示为两个生物复制品的GFP阴性细胞±SD的平均百分比。（H） 中每个CpG的甲基化水平Snarpn公司启动子区及其邻近区域Gapdh公司G中细胞的位点表示两个生物复制品的平均百分比±SD。另请参见图S2。
图3
图3
靶向去甲基化BDNF公司启动子IV通过dCas9-Tet1激活神经元中的BDNF。（A） 瞄准示意图BDNF公司启动子IV通过dCas9-Tet1（dC-T）与特定gRNAs清除甲基化并激活BDNF表达。（B） 培养的小鼠皮层神经元在体外用表达dC-T的慢病毒感染3天（DIV3），所述慢病毒具有或不具有靶向BDNF公司促进剂IV或催化死亡形式的Tet1（dC-dT）BDNF公司gRNAs 2天，然后在采集用于RT-qPCR分析之前，使用或不使用KCl（50 mM）处理6小时。条形图是三个生物复制品的平均值±SD。（C） B中BDNF诱导的典型共焦图像。MAP2（顶部两个面板）或樱桃色（底部两个面板的）为红色，BDNF为绿色，DAPI为蓝色，dCas9为灰色。比例尺：50 um。（D）C.（E）中神经元的亚硫酸氢盐测序BDNF公司启动子IV区。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。另请参见图S4。
图4
图4
靶向去甲基化MyoD公司dCas9-Tet1促进成纤维细胞向成肌细胞转化的远端增强子。（A） 目标的示意图MyoD公司通过dCas9-Tet1（dC-T）和特异性gRNAs在DMR-5中的远端增强子（DE）区域。（B） 用目标gRNAs表达dC-T的慢病毒感染C3H10T1/2细胞，或用目标gRNA表达催化死亡形式的Tet1（dC-dT），持续2天。樱桃阳性细胞经FACS筛选后进行RT-qPCR分析。条形代表三个实验重复的平均值±SD。（C） B（D）甲基化水平的细胞亚硫酸氢盐测序MyoD公司DE区域。所示为两个生物复制品的平均百分比±SD。（E） 成纤维细胞-成肌细胞转化试验第14天C3H10T1/2细胞的典型共焦图像。MyoD为绿色，MHC为洋红色，DAPI为蓝色。比例尺：200μm。（F）用靶向DMR-5的gRNAs对仅表达dC-T、dC-T或dC-dT的慢病毒感染14天后MyoD阳性细胞比率进行量化。（G） 感染后14天，基于每个MHC+簇的细胞核数的MHC阳性细胞簇分布情况（分为2-5、6-10、11-20和>20个细胞核/MHC+束）。（H） 感染后14天，具有2个或5个以上细胞核的MHC阳性簇中肌管密度的定量。从F-H的3-5个代表性图像中量化数据。条形图表示平均值±标准偏差。另请参见图S5。
图5
图5
CTCF结合位点的靶向甲基化。（A） dCas9-Dnmt3a靶向CTCF结合位点的示意图从头开始甲基化，阻断CTCF募集，并打开CTCF环，从而改变相邻环中的基因表达。（B） CTCF目标-1的示意图(290英里基因座）与超级增强器和290英里在循环中，8091年8月1日左邻接环中的基因，以及第12页右邻近环中的基因（靠近靶向CTCF结合位点）。这个Myadm公司基因位于包含第12页。超级增强器域以红色条表示。目标CTCF站点用方框突出显示。图中还显示了黑色CTCF和红色H3K27Ac（超级增强器）的ChIP-seq结合谱（每对碱基百万读数），以及黄色甲基化轨道和蓝色DMR。（C–E）多西环素诱导的dCas9-Dnmt3a mESCs被表达扰乱gRNA或CTCF靶1 gRNA的慢病毒感染。对樱桃阳性细胞进行FACS分类，在多西环素存在下培养，然后在C中采集用于RT-qPCR分析，在D&E中进行亚硫酸氢序列分析。条形图表示三个实验重复的平均值±SD。（F） CTCF target-2与超级增强子和Pou5f1基因在此循环中的示意图，如B所示。（G–I）对CTCF target-2进行了与C-E中所述相同的一组实验，并采集细胞进行RT-qPCR分析，以及D和E中的亚硫酸氢盐测序。条形代表三个实验重复的平均值±SD。另请参见图S6。
图6
图6
靶向甲基化CTCF结合位点以操纵CTCF环。（A） 图5C所示细胞的定量染色体构象捕获（3C）分析290英里轨迹。超级增强器域以红色条表示。目标CTCF站点用方框突出显示。箭头表示分析相互作用频率的染色体位置。星号表示3C锚点。还显示了黑色CTCF和红色H3K27Ac（超级增强子）的ChIP-seq结合谱（百万碱基对读数），以及黄色DMR和蓝色DMR的甲基化轨迹。所示染色体位置和3C锚定位点之间的相互作用频率在底部面板上显示为条形图（平均值±SD）。qPCR反应重复进行，数值根据细胞中带有干扰gRNA的平均相互作用频率进行标准化。（所有三个区域均p<0.05；Student’s t检验，ns代表无显著性，NC代表阴性对照。）（B）使用A中的细胞进行抗-CTCF ChIP实验，然后进行定量PCR分析。条形代表三个实验重复的平均值±SD。（C） 图5G所示细胞的定量染色体构象捕获（3C）分析磅5f1基因座如A。（D）使用C中的细胞进行抗CTCF ChIP实验，然后进行定量PCR分析。条形图代表三个实验重复的平均值±标准差。
图7
图7
有针对性的体外和体内dCas9-Tet1编辑DNA甲基化以激活沉默的GFP报告子。（A） 演示实验程序的示意图体外在小鼠成纤维细胞中激活沉默的GFP报告子。小鼠尾部成纤维细胞来源于携带父亲IG-DMR-Snrpn-GFP等位基因（IG-DMR）的转基因小鼠系GFP/专利)在中Dlk1-二极管3轨迹。这个IG-DMR-Snrpn公司父系等位基因上的启动子被高度甲基化，因此GFP报告子构成性沉默。用表达dCas9-Tet1和gRNAs的慢病毒载体感染培养的成纤维细胞，使其去甲基化Snarpn公司启动并激活GFP报告子。（B） IG-DMR的典型免疫组化图像GFP/专利感染慢病毒的成纤维细胞用sc-gRNA表达dCas9-Tet1（dC-TSnarpn公司靶gRNA或dCas9-Tet1Snarpn公司靶gRNA。红色代表樱桃，绿色代表GFP，DAPI代表细胞核。比例尺：100 um。（C）IG-DMR百分比的量化GFP/专利樱桃（gRNAs）阳性细胞中GFP激活的小鼠成纤维细胞。条形代表三个实验重复的平均值±SD。（D） 演示以下实验程序的示意图体内IG-DMR中GFP报告子的激活绿色荧光蛋白/专利小鼠大脑。表达dC-T和sc-gRNA、dC-dT和Snarpn公司靶gRNAs、dC-T和Snarpn公司靶gRNAs通过立体定向微注射方法传递。用免疫组织化学方法对大脑进行切片和分析。（E） IG-DMR的代表性共焦显微照片GFP/专利感染dC-T和sc-gRNA、dC-dT和Snarpn公司靶gRNAs、dC-T和Snarpn公司靶gRNAs。只有带有靶gRNAs的dC-T激活了GFP表达。比例尺：100 um。（F）E.装箱区域的共焦显微照片。E和F中的核用红色表示樱桃色，绿色表示GFP，DAPI表示。比例尺；25 um。（G–H）IG-DMR百分比的量化GFP/专利绿色荧光蛋白激活的细胞中樱桃（gRNAs）阳性细胞体内慢病毒在大脑（G）和皮肤表皮（H）中的传递实验。横线表示来自2只动物的四个以上代表性图像的平均值±SD。另请参见图S7。
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