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.1989年8月15日;264(23):13489-96。

蛋白激酶C调控域和催化域的分子遗传学分析

附属公司
  • PMID: 2760032
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蛋白激酶C调控域和催化域的分子遗传学分析

K凯布奇等。 生物化学杂志. .
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摘要

我们构建了含有蛋白激酶C(PKC)突变cDNA的表达质粒,该cDNA在PKC编码区有一系列缺失。将这些质粒转染COS7细胞以鉴定PKC突变体。使用抗PKC抗体进行的免疫印迹分析确定了具有预期Mr值的蛋白质,这些蛋白质来自COS7细胞提取物中的PKC突变cDNA。野生型PKC在COS7细胞中表达时,增强了完整细胞的佛波酯结合活性;但在C1区附近缺失的PKC突变体没有表现出这种活性。野生型PKC表现出依赖磷脂、Ca2+和佛波酯的蛋白激酶活性,而这些PKC突变体在无细胞系统中表现出独立于活化剂的蛋白激酶活力。在C2区缺失的PKC突变体cDNA增加了佛波酯结合活性。与野生型PKC相比,该突变体的蛋白激酶活性对Ca2+的依赖性小得多。在C3区缺失的PKC突变体cDNA增强了佛波酯结合活性,但不具有激活剂依赖性或独立性蛋白激酶活性。这些结果表明,PKC的C1区域被消除后,产生了独立于磷脂、Ca2+和佛波酯的组成活性PKC,并且C1-C3区域在PKC的调节和催化功能中发挥着不同的作用。在另一系列实验中,将一些在C1区附近缺失的PKC突变体cDNA转染到中国仓鼠卵巢和Jurkat细胞中,在没有佛波酯的情况下激活激活蛋白-1结合元件或与氯霉素乙酰转移酶报告基因相连的c-fos基因增强子。将这些构建物微量注射到非洲爪蟾卵母细胞中可诱导生发泡破裂的启动,表明它们在体内刺激了PKC通路。因此,佛波酯依赖性PKC突变体cDNA可能是研究PKC介导的跨膜信号通路的有力工具。

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