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。2016年11月；30(11):3771-3785.
doi:10.1096/fj.201600450R。 Epub 2016年8月22日。

长期服用线粒体靶向抗氧化剂甲磺酸米托醌不能减轻与年龄相关的氧化损伤或挽救与骨骼肌衰老相关的肌肉质量和功能损失

Giorgos K Sakellariou公司 1, 蒂莫西·皮尔逊 1, Adam P Lightfoot公司 1, 加雷思·阿奈 1, 尼古拉·韦尔斯 1, 伊菲涅娅·贾库马基 1, 理查德·格里菲斯 1, 安妮·麦卡德尔 1, 马尔科姆·J·杰克逊 2
附属公司

长期服用以线粒体为靶点的抗氧化剂甲磺酸米托醌不能减轻与年龄相关的氧化损伤或挽救与骨骼肌老化相关的肌肉质量和功能的丧失

Giorgos K Sakellariou公司等。 美国财务会计准则委员会J。 2016年11月。

摘要

与年龄相关的骨骼肌功能障碍是发病的根本原因，影响到多达一半的80岁及以上人口。大量证据表明，氧化损伤和线粒体功能障碍导致了随着年龄增长而出现的肌肉减少表型。为了验证这一点，我们给野生型C57BL/6小鼠服用了线粒体靶向抗氧化剂甲磺酸米托醌{[10-（4,5-二甲氧基-2-甲基-3,6-二氧基-1,4-环己二烯-1-基）癸基]三苯基鏻；100μM}15周（24-28个月龄），并研究了对与年龄相关的肌肉质量和功能损失的影响，氧化还原稳态、线粒体细胞器完整性和功能的变化。我们发现甲磺酸米托醌治疗未能预防与肌纤维萎缩相关的骨骼肌重量的年龄依赖性丢失，也未能改变各种原位和离体肌肉功能分析，包括最大等长强直力、强直疲劳方案后的力下降以及单纤维比力。我们还发现，长期给予甲磺酸米托醌并没有减少线粒体活性氧物种，也没有引起肌肉氧化还原稳态的显著变化，如4-羟基壬醛蛋白加合物、蛋白质羰基含量、蛋白质硝化、，DNA损伤由8-羟基脱氧鸟苷含量决定。经甲磺酸米托醌处理后，在渗透性肌纤维中评估的线粒体膜电位、丰度和呼吸没有显著改变。总之，这些发现表明，长期给予甲磺酸米托醌靶向线粒体未能减轻老年小鼠骨骼肌中与年龄相关的氧化损伤，也未能在肌肉老化的情况下提供任何保护作用-Sakellariou，G.K.，Pearson，T.，Lightfoot，A.P.，Nye，G.A.，Wells，N.，Giakoumaki，I.I.，Griffiths，R.D.，McArdle，A.，Jackson，M.J。长期服用以线粒体为靶点的抗氧化剂甲磺酸米托醌未能减轻与年龄相关的氧化损伤或挽救与骨骼肌老化相关的肌肉质量和功能损失。

关键词：核因子-κB；NOX4；草地；热休克蛋白；超氧化物。

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数字

图1。
图1。
肌萎缩与肌纤维萎缩有关。A类)AT肌肉质量的年龄相关变化，归一化为体重*P（P）与其他年龄组的值相比<0.05(n个=每组6-8只小鼠）。B类)用WGA（5μg/ml，红色）染色18月龄小鼠AT肌的横切面，以观察细胞外基质，并评估单个纤维的总纤维数和CSA。比例尺，500μm。C类)18岁和28岁小鼠AT肌中的肌纤维数量。D类)18岁和28岁小鼠AT肌单个纤维的平均CSA*P（P）与18个月龄小鼠的值相比<0.05(n个=每组6-8只小鼠）。
图2。
图2。
长期服用甲磺酸米托醌（MitoQ）对老年小鼠骨骼肌mtROS的影响。A类)上面板：在用MitoSOX红（20 nM，青色）加载后的亮场荧光图像下，从AT肌肉分离出的单个纤维的代表性图像，以及通过共焦显微镜显示和分析的合并图像。原始放大倍数，×60。比例尺，25μm。下面板：线粒体2-OH-Mito-E下面积的统计分析+对照组老年小鼠和接受MitoQ治疗15周（24-28月龄）的小鼠的荧光示踪（曲线下面积）超过60分钟，任意单位（AU）。2-羟基-Mito-E+荧光归一化为CS活性*P（P）与MitoQ治疗的老年小鼠的值相比<0.05(n个=12根纤维，每组5-6只小鼠）。B类)用To-Pro-1碘化物（200 nM，绿色）和DAPI（1μg/ml，蓝色）加载后，从AT肌肉分离的皂苷通透性纤维在亮场荧光图像下的共焦图像；荧光显微镜显示和分析的合并图像。原始放大倍数，×60。比例尺，25μm。C类)线粒体H2O（运行）2在从对照组和米托Q处理的老年小鼠的AT肌肉制备的渗透性纤维束中评估生产（每CS活性归一化）。如图所示，添加线粒体底物和抑制剂-谷氨酸和苹果酸（G/M；两者均为5 mM）、琥珀酸（S；10 mM）和鱼藤酮（Rot；1μM）(n个=每组5-6只小鼠）。D类)对照组和MitoQ处理的老年小鼠AT肌肉中氧化磷酸化（oxphos）复合物（I、II、III和V）的蛋白质水平。在胭脂红S染色凝胶中显示的条带强度（上图）相当于GAPDH和长春花蛋白水平（下图），并用作负载对照。E类)GAPDH和电压依赖性阴离子通道3（VDAC3）含量的代表性Western blot，以说明提取的线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）骨骼肌部分的纯度。F类)对照组和MitoQ处理的老年小鼠骨骼肌线粒体部分中NOX4的蛋白质水平。G公司)对照组和米托Q处理的老年小鼠AT骨骼肌匀浆中鱼藤酮敏感呼吸链复合物I的活性(n个=每组5-6只小鼠）。H（H）)天然凝胶染色以检测对照组和经MitoQ处理的老年小鼠（上部）AT骨骼肌中的SOD1和SOD2酶活性，以及条带的密度定量（下部）。阴性对照（NC）包括来自Sod1-null小鼠的AT肌肉裂解物。
图3。
图3。
甲磺酸米托醌（MitoQ）治疗老年小鼠骨骼肌氧化损伤标记物。A类)Western blot分析和定量（右下）对照组和MitoQ治疗组老年小鼠线粒体（右上）和细胞溶质（左下）骨骼肌部分以及AT裂解物（左上）中的蛋白质羰基。B类)对照组和MitoQ治疗的老年小鼠线粒体（左上）和细胞溶质骨骼肌部分（左下）中4-HNE蛋白加合物的Western blot分析（左）和定量（右）。C类)骨骼肌基因组DNA中8-OHdG的水平（左上），对照组和MitoQ处理的老年小鼠骨骼肌OGG1蛋白水平（下），以及印迹密度定量(n个=每组5-6只小鼠；右上角）。D类)对照组和MitoQ处理的老年小鼠骨骼肌的3-NT含量（左上）和PRXV蛋白水平（下）以及印迹密度定量(n个=每组5-6只小鼠；右上角）。
图4。
图4。
长期甲磺酸米托醌（MitoQ）治疗对老年小鼠骨骼肌RONS调节蛋白表达的影响。A类)典型的Western blot描绘了对照组和MitoQ治疗的老年小鼠AT裂解物和线粒体/细胞溶质骨骼肌部分中SOD亚型的表达。B类)对照组和米托Q处理的老年小鼠AT裂解物中NOS亚型的蛋白表达水平。C类)主H的蛋白质斑点2O（运行）2-对照组和线粒体处理的老年小鼠AT裂解液中的还原酶，包括过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）和PRXIII。D类)TRX-PRX系统中涉及的主要氧化还原蛋白的蛋白表达，包括TRX1、TRX2、TRXR1和TRXR2，在对照组和MitoQ处理的老年小鼠的AT裂解物中。E类)对照组和MitoQ治疗的老年小鼠AT裂解物中热休克蛋白的Western blots。F类)所示代表性蛋白质印迹的密度分析A–E. *P（P）与老年对照小鼠的值相比，<0.05。G公司)长期MitoQ治疗对总的和磷酸化的IκB-α（磷酸化IκB-α）和P65含量（总的和磷酸化的）（左下）以及斑点密度定量（右下）的影响。考马斯亮蓝染色凝胶（左上）用作装载控制。M、 分子量标记。
图5。
图5。
长期服用甲磺酸米托醌（MitoQ）对老年小鼠骨骼肌线粒体含量和有丝分裂的影响。A类)实时qRT-PCR测量对照组和MitoQ处理的老年小鼠骨骼肌mtDNA的核DNA（nDNA）量(n个=每组5-6只小鼠）。B类)对照和MitoQ治疗的老年小鼠骨骼肌中CS活性(n个=每组5-6只小鼠）。C类)GAPDH、B2M、RPS29、COXI、COXIV、CS、MCIP1、线粒体转录因子A（TFAM）、PGC-1α、核呼吸因子1（NRF1）、OPA1、MNF1、MNF2、FIS1和DRP1转录物实时RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳代表图（上部）。通道1和17，100 bp DNA分子量标记。PCR产物对应于表1中列出的扩增子大小。实时qRT-PCR分析线粒体生物发生和动力学相关基因的相对mRNA水平（较低）。mRNA水平根据看家基因GAPDH、B2M和RPS29进行标准化。D类)对照和MitoQ处理的老年小鼠AT骨骼肌中sirtuin 1（Sirt1）和PGC-1α线粒体生物发生调节因子的蛋白表达（左），以及印迹的密度定量（右）。E类)免疫检测PINK1、泛素连接酶Parkin、线粒体自噬标记物（左）和印迹的密度定量（右）的来自对照和MitoQ处理的老年小鼠的骨骼肌的分离线粒体部分的蛋白质印迹。
图6。
图6。
甲磺酸米托醌（MitoQ）治疗老年小鼠骨骼肌的线粒体功能。A类)28岁对照组和经MitoQ处理的小鼠AT骨骼肌中线粒体顺乌头酸酶（ACONS）活性(n个=每组5-6只小鼠）。B类)Western blot分析和定量（右下）线粒体（右上）和细胞溶质（左下）骨骼肌部分中的ACONS，以及对照组和MitoQ治疗的老年小鼠的AT裂解物（左上）。C类)加载TMRM荧光（20 nM，红色）后，在亮场荧光图像下从AT肌分离的单纤维的共焦图像；荧光显微镜显示和分析的合并图像。原始放大倍数，×60。比例尺，30μm（上部）；ΔΨ的测量米在指定的时间点（中心）添加寡霉素（Olm；2.5μM）和FCCP（4μM）后，通过TMRM荧光变化评估来自对照组和MitoQ处理的老年小鼠的分离AT纤维的完整线粒体；对照组和米托Q处理的老年小鼠TMRM荧光示踪面积（曲线下面积）的统计分析(n个=10-12根纤维，每组5-6只小鼠；下部）。D类)对照组和MitoQ治疗组老年小鼠皂苷通透性肌纤维中完整线粒体的呼吸功能表现为RCI（左）和ATP量与消耗O的比值的变化2状态3期间（P:O比率）（右）(n个=每组5-6只小鼠）。E类)对照组和MitoQ处理的老年小鼠骨骼肌中UCP2和UCP3蛋白水平（左）和斑点密度定量（右）。
图7。
图7。
长期甲磺酸米托醌（MitoQ）治疗对骨骼肌线粒体介导的凋亡的影响。A类)对照组和经MitoQ治疗的老年小鼠骨骼肌中BAK、BAX和VDAC1促凋亡蛋白的免疫印迹（左）和印迹的密度定量（右）。B类)对照组和米托Q处理的老年小鼠肌肉中钙蛋白酶I和钙蛋白酶蛋白酶的蛋白质表达水平（左）和斑点密度定量（右）。C类)免疫检测对照组和MitoQ处理组小鼠细胞溶质分离部分的细胞色素蛋白印迹c（c）（周期C类)Smac/DIABLO线粒体促凋亡蛋白（左）和斑点密度定量（右）。D类)对照组和经MitoQ处理的老年小鼠（左）骨骼肌线粒体部分中促凋亡因子内切酶G（Endo G）的蛋白水平和斑点密度定量（右）。E类)用琼脂糖凝胶电泳分析从对照组和米托Q处理的老年小鼠骨骼肌中分离的基因组DNA的DNA片段。泳道1和10，1kb DNA分子量标记。
图8。
图8。
长期甲磺酸米托醌（MitoQ）治疗对年龄相关性肌肉质量和功能丧失的影响。A类)有丝分裂原靶向MitoQ给药15周期间小鼠体重变化的时间进程。趋势线表明治疗期间体重无变化；每周监测体重(n个=每组5-6只小鼠）。B类)在15周的治疗期后，获得28个月大的对照和MitoQ治疗小鼠的AT肌肉横截面，并用WGA（5μg/ml，绿色）染色以显示细胞外基质和DAPI（1μg/ml，蓝色）标记细胞核。比例尺，400μm。C类)对照组和米托Q处理的老年小鼠AT肌中显示中央定位细胞核的纤维百分比（左上）；对照组和MitoQ处理的老年小鼠AT肌中的肌纤维总数（右上）；对照组和MitoQ处理的老年小鼠AT肌单个纤维的平均CSA(n个=每组5-6只小鼠；下部）。D类)对照组和米托Q处理的老年小鼠AT肌纤维CSA的频率分布(n个=每组5-6只小鼠）。E类)对照组和MitoQ处理的老年小鼠腓肠肌（GTN，上部）和AT肌（下部）中快速[肌球蛋白重链（MHC）快速]和慢速（MHC慢速）MHC含量的代表性Western blots。F类)测得的最大等距比力现场，对照组和MitoQ处理的老年小鼠EDL肌肉的总纤维CSA标准化(n个=每组5-6只小鼠）。G公司)现场测量EDL肌肉在一系列重复等长收缩（每5秒100 Hz 300 ms）期间的最大等长比力下降，以初始力的百分比表示。线条代表5块肌肉的平均反应(n个=每组5只小鼠）。虽然与对照组相比，经MitoQ治疗的老年小鼠在疲劳试验期间表现出等长肌力产生更大的下降趋势，但数据在统计学上并不显著。H（H）)附在力传感器和高速长度控制器上的28岁小鼠AT肌分离出的皮肤肌纤维图像。比例尺，350μm。我)体外对照组和MitoQ处理的老年小鼠AT肌分离的皮肤肌纤维的最大纤维比力归一化为纤维CSA的测量(n个=25根纤维，每组5只小鼠）。J型)体外对照组和米托Q处理的老年小鼠AT肌分离的皮肤纤维达到峰值张力的时间测量(n个=25根纤维，每组5只小鼠）。
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