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.2016年8月25日；536(7617):479-83.
doi:10.1038/nature19084。 Epub 2016年8月10日。

胰腺星状细胞通过自噬丙氨酸分泌支持肿瘤代谢

Cristovão M Sousa公司, 道格拉斯·比安库尔, 王晓旭, 克里斯托弗·哈尔布鲁克, 玛拉·谢尔曼, 李章, 丹尼尔·克莱默, 罗莎·F·黄, 阿格尼斯·维奇维茨（Agnes K Witkiewicz）, 郝强英, 约翰·M·阿萨拉, 罗纳德·M·埃文斯, 刘易斯·C·坎特利, Costas A Lyssiotis公司, 亚历克·金默尔曼

胰腺星状细胞通过自噬性丙氨酸分泌支持肿瘤代谢

克里斯托夫·穆索萨等。 自然. .

勘误表in

  • 勘误表：胰腺星状细胞通过自噬性丙氨酸分泌支持肿瘤代谢。
    Sousa CM、Biancur DE、Wang X、Halbrook CJ、Sherman MH、Zhang L、Kremer D、Hwang RF、Witkiewicz AK、Ying H、Asara JM、Evans RM、Cantley LC、Lyssiotis CA、Kimmelman AC。 Sousa CM等人。 自然。2016年12月1日；540(7631):150. doi:10.1038/nature19851。Epub 2016年10月5日。 自然。2016 PMID：27706144 没有可用的摘要。

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种侵袭性疾病，其特征是强烈的纤维化基质反应和代谢失调。基质在PDAC生物学中的作用是复杂的，并且已经证明它发挥着关键的作用，这取决于生物背景。基质反应也会损害血管系统，导致高度缺氧、营养不良的环境。因此，这些肿瘤必须改变其捕获和使用营养物质的方式，以支持其代谢需求。在这里，我们表明基质相关胰腺星状细胞（PSCs）通过分泌非必需氨基酸（NEAA）对PDAC代谢至关重要。具体而言，我们揭示了丙氨酸以前未描述的作用，丙氨酸在PDAC中竞争葡萄糖和谷氨酰胺衍生碳，以促进三羧酸（TCA）循环，从而促进NEAA和脂质生物合成。燃料来源的这种转变降低了肿瘤对葡萄糖和血清衍生营养素的依赖性，而葡萄糖和血清源营养素在胰腺肿瘤微环境中是有限的。此外，我们证明PSC分泌丙氨酸依赖于PSC自噬，这是一个由癌细胞刺激的过程。因此，我们的结果证明了PSC和癌细胞之间的一种新的代谢相互作用，其中PSC衍生的丙氨酸作为替代碳源。这一发现突显了胰腺肿瘤中以前未被认可的代谢网络，在该网络中，不同的燃料来源被用于在严峻的肿瘤微环境中促进生长。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者们宣布了相互竞争的经济利益：详情可在论文的在线版本中获得。

数字

扩展数据图1
扩展数据图1。胰腺星状细胞分泌代谢物，PDAC利用代谢物促进其代谢
a–c，来自人类胰腺星状细胞（PSC）系（hPSC#1和hPSC#2）的条件培养基（CM）增加了多个PDAC细胞系的耗氧量（OCR）：一，图8902，b、MiaPaCa2和c（c），窗格-1。数据表示为用条件培养基处理的细胞与用含有10%血清的新鲜DMEM处理的细胞相比，OCR增加了%。误差条表示n个=5，用于一和n个=3用于b,c（c），除了hPSC#1-条件培养基b哪里n个=4，来自独立实验。进行单因素方差分析。一, ***P（P）=0.0004，对于hPSC#1与对照，P（P）=0.0018，对于hPSC#2与对照；b, ***P（P）< 0.0001;c、，*P（P）=0.0293.d日,e（电子）8988T细胞经不同细胞系的条件培养基处理后，细胞外酸化率（ECAR）无明显变化。典型的海马轨迹如所示d日误差条显示了来自6个独立实验的代表性示踪的6个独立井的s.d.（如e（电子）).e（电子），使用来自多个PDAC和PSC系（包括原发性hPSC）的条件培养基的结果。误差条表示n个=3，适用于MiaPaCa2、IMR-90、初级hPSC#1和#2，以及n个在独立实验中，8988T条件培养基和hPSC#1为6。（f）,克，在无血清条件下从hPSC#1和hPSC#2中获得的条件培养基保留了增加8988T OCR的能力(（f）)和Tu8902(克)细胞系。数据表示为用条件培养基处理的细胞与用新鲜的无血清DMEM处理的细胞相比，OCR增加了%。误差条表示3个独立实验的标准误差。单因素方差分析。（f）, ***P（P）< 0.0001;克, ***P（P）=0.0005，对于hPSC#1与对照，P（P）与对照组相比，hPSC#2小于0.0001。小时，通过RT–qPCR鉴定PSC（初级hPSC#1和#2以及hPSC#1和#2）。来自肿瘤的原发性PSC以与hPSC细胞系相似的方式显示活化的星状细胞特征，活化的成纤维细胞标记物平滑肌肌动蛋白（αSMA）和星状细胞标记物结蛋白的高表达证明了这一点。mRNA水平表示为与8988T细胞相比的倍数变化。IMR90（来自肺组织的人成纤维细胞）和来自无病胰腺的人PSC（原发性hPSC N）作为对照。注：将正常PSC转移到组织培养环境也会导致激活。表达水平归一化为β-肌动蛋白。误差条表示三个重复井的标准差。我如油红O染色所示，活化的hPSC没有脂滴，脂滴是活化状态的指示物。Tu8902作为阳性染色对照。j个来自hPSC的条件培养基不会改变非转化胰腺导管细胞（HPDE）的OCR。误差条表示来自代表性实验（3个独立实验）的五重井的s.d。单向方差分析：P（P）> 0.9.k–m（千米）在100°C下煮沸15分钟后，hPSC调节介质提高PDAC OCR的能力在Tu8902和Tu8902中都得到了保留(k个)和MiaPaCa2(我)以及在8988T温度下连续三次冷冻（−80°C，10分钟）-解冻（60°C，10min）循环后，如米误差条表示代表性实验（共3个实验）中4个独立井的标准差。单向方差分析。k个, *P（P）=0.0004，对于hPSC#1煮沸条件培养基与对照，P（P）=0.0001，对于hPSC#1-条件培养基与对照；我, ***P（P）=0.0002，对于煮沸的hPSC与对照，P（P）hPSC与对照组相比<0.0001；米, *P（P）=0.0011.n个hPSCs分泌的增加PDAC OCR的因子保留在hPSC调节培养基的<3kDa部分中。误差条表示3个独立实验的标准误差。单向方差分析*P（P）=0.0175, ***P（P）=0.0007，对于hPSC与对照，P（P）<3kDa时=0.0015，与对照组相比。
扩展数据图2
扩展数据图2。丙氨酸由胰腺星状细胞分泌并被PDAC细胞消耗
一，图1d中描述的代谢组学实验示意图。b氨基酸丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和天冬酰胺由PSC分泌，PDAC细胞消耗。图1d中也显示了此处的丙氨酸数据。误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。t吨-进行了丙氨酸测试：*P（P）=0.0176, **P（P）= 0.0097; 对于谷氨酸*P（P）=0.0108, ***P（P）= 0.0024; 脯氨酸*P（P）=0.0013，对于hPSC#1条件培养基与8988T条件培养基，P（P）=0.0024（对于双条件培养基）与8988T条件培养基；对于天冬酰胺*P（P）=0.0125.c（c），非必需氨基酸混合物（1 mM NEAA：丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸）以与PSC调节培养基相似的方式增加MiaPaCa2 OCR。在这些NEAA中，只有丙氨酸可以增加PDAC OCR，达到与NEAA混合物相当的程度。将数据归一化为用含10%血清的新鲜DMEM处理的细胞。误差条表示3个实验的标准误差***P（P）< 0.0001.d日，U型剖面-13C-葡萄糖和U-13hPSCs的C-谷氨酰胺衍生NEAA分泌体。误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。e（电子），PSC标记为U饱和-13C-葡萄糖和U-13C-谷氨酰胺。丙氨酸是唯一一种在PSC条件培养基（与8988T条件培养基相比）中表现出统计显著增加而在双重条件培养基中表现出减少的标记代谢物（添加到8998T细胞中的PSC条件条件培养基）。误差线，s.d.ofn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。一条双尾蛇t吨-进行了测试***P（P）< 0.0001.（f），丙氨酸标准曲线由LC-MS/MS测定。来自hPSC（绿色菱形）、8988T（红色三角形）和Tu8902（红色方形）的条件培养基的数据点显示在丙氨酸标准图上。这些数据如图1f所示，单位为μM/106细胞。误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。t吨-测试***P（P）< 0.0001.克,小时，丙氨酸由PSC分泌(克)或缺席(小时)血清。误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。t吨-执行的测试；克, ***P（P）<0.0001，对照组与hPSC#1，P（P）相对于hPSC#2，对照组为0.0007；小时, ***P（P）=0.0003，对照组与hPSC#1，P（P）=0.0004，对照组与hPSC#2。我，使用LC-MS测定72小时内PSC-Ala分泌到条件培养基中的速率；误差条代表的s.dn个=4份来自独立井的独立制备样品的技术副本。j个,k个、氨基酸水平(j个)和乳酸(k个)在经hPSC#1调节的完全培养基中进行72小时的监测。丙氨酸是分泌量最大的代谢物，甚至超过了乳酸。代谢物水平标准化为时间0（新鲜DMEM和10%透析血清）。误差条表示的是n个=4份来自独立井的独立制备样品的技术副本。进行双向方差分析***P（P）< 0.0001. 丙氨酸使用相同的数据，并以曲线表示i–k。我经hPSC#1条件培养基处理的8988T细胞对丙氨酸的消耗量最大。误差条表示的s.dn个=4份来自独立井的独立制备样品的技术副本。进行双向方差分析***P（P）最后一个时间点小于0.0001。
扩展数据图3
扩展数据图3。星状细胞分泌的丙氨酸被PDAC用于促进生物合成反应
a–c、敲除PDAC细胞中的GPT1或GPT2(一)显著减弱hPSC条件培养基提高Tu8902细胞OCR的能力(b). 用来自8988T细胞中独立hPSC系的条件培养液重复此观察(c（c）). 误差条表示3个独立实验的标准误差。单向方差分析；b、，*P（P）=0.0134;c（c）, *P（P）=0.0129.d–j，使用U进行代谢追踪研究-13C-Ala和U-13C-丙酮酸（Pyr）(f–h).d日，使用U进行代谢追踪研究-138988T细胞中的C-Ala。误差线，s.d.ofn个= 3. 进行双向方差分析：丙氨酸***P（P）< 0.0001; 对于乳酸***P（P）=0.0001, **P（P）=0.0086.e（电子）用1 mM丙氨酸处理的Tu8902细胞中的细胞内丙氨酸积累和标记。进行双向方差分析：***P（P）< 0.0001.f–h在含有不同葡萄糖（Glc）浓度（0.5、10、25 mM）的培养基中，用1 mM丙酮酸或1 mM丙氨酸处理的8988T细胞中的细胞内丙氨酸积累和标记。误差条代表的s.dn个=3.我,j个，U-13正如8988T中的代谢物葡萄糖6-磷酸（G6P）、果糖6-磷酸（F6P）和果糖二磷酸（FBP）、甘油醛3-磷酸（Ga3P）、3-磷酸甘油酯（3PG）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）所示，C-Ala不促进糖酵解或糖异生(我)或Tu8902(j个)PDAC细胞系。标签可以独立于糖酵解并入乳酸（Lac）。误差条代表的s.dn个=3.k个，1 mM丙氨酸不会显著增加8988T细胞的基础细胞外酸化率（ECAR）。误差条代表6个重复的s.d。代表性实验（共3个实验）的数据，P（P）=0.6082.我,米，丙氨酸对8988T细胞中NAD+/NADH比率的改变程度与丙酮酸在含有0.5 mM(我)或25 mM(米)细胞外葡萄糖。对照组包括10 mM丙酮酸和10 mM乳酸；误差条表示的s.e.mn个=4 (我)或n个=3 (米)独立实验。t吨-执行的测试；我, *P（P）=0.0205;米, *P（P）=0.0291.n–q个，丙氨酸对Tu8902中的乳酸贡献最小(n个)和8988T(o–q号)细胞，不依赖于培养基中的葡萄糖浓度，如U示踪所示-13丙氨酸：0.5 mM(o（o）)，10毫微米(第页)或25mM(q个)葡萄糖。丙酮酸标签约占8988T细胞乳酸池的50%(o–q号)与培养基中的葡萄糖浓度无关。误差条表示的s.dn个=3.d–j日,否,n个=3个技术副本，来自独立制备的单井样品
扩展数据图4
扩展数据图4。丙氨酸为8988T PDAC细胞中的TCA循环提供燃料
一，1百万单位-138988T细胞24小时的C-Ala标记显示丙氨酸碳并入TCA循环代谢物柠檬酸（Cit）、异柠檬酸（Iso）、富马酸（Fum）、苹果酸（Mal）和NEAAs、天冬氨酸和谷氨酸中，并由此衍生。这些数据在图2中显示为分数标记（图2e）和包含标记的柠檬酸盐池的百分比（图2f）。M0是指无重碳的未标记代谢物（未标记同位素，12C），M1是一个有重碳的同位素(13C） 碳可以在分子中的任何位置，M2是含有任意两个重碳的代谢物(13C） ，M3加3，依此类推。给定物种的最大M表示13C标记的同位素（例如，对于具有6个碳骨架的柠檬酸盐，它应该是M6）。在示意图中，U-13C-Ala表示为三个红色球，每个球都描绘了一个标记的碳原子。这被转换为U-13C-Pyr（M3）穿梭进入线粒体-13C-Pyr到Ac-CoA导致一个碳作为CO损失2然后将Ac-CoA添加到草酰乙酸（OAA）中形成2-13C标记柠檬酸盐（M2）。这种柠檬酸盐在TCA循环中循环并代谢为其他TCA循环代谢物。碳标签图案用红色（有标签）和白色（无标签）球表示。αKG，α-酮戊二酸；简洁，简洁。b–e类，丙氨酸和丙酮酸对TCA循环代谢物柠檬酸的贡献(b)，异柠檬酸(c（c）)，富马酸盐(d日)和苹果酸(e（电子）)如U所示-13C-Ala和U-13在含有10 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中对8988T细胞进行C-Pyr示踪。f–k，丙氨酸对TCA循环代谢物柠檬酸的贡献(（f）)，异柠檬酸(克)，富马酸(小时)和苹果酸(我)以及NEAAs Glu(j个)和Asp(k个)与培养基中的葡萄糖浓度无关，如U所示-13在含有0.5 mM、10 mM或25 mM葡萄糖的培养基中进行C-Ala示踪。数据表示为总离子流；误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。的原始数据b–k如补充信息图2a–j所示。
扩展数据图5
扩展数据图5。丙氨酸碳对多种PDAC细胞系的TCA循环有贡献
a–d，1 mM单位-13Tu8902的C-Ala标记(一)、MiaPaCa2(b)，面板-1(c（c）)和mPanc96(d日)细胞显示丙氨酸碳并入TCA循环代谢物柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸和富马酸以及NEAAs Asp和Glu。数据表示为总离子流；误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。这些数据如图2f所示，是柠檬酸盐池中加入标签的百分比。
扩展数据图6
扩展数据图6。丙氨酸可以缓解PDAC细胞对葡萄糖和谷氨酰胺碳的需求，从而为其他生物合成过程提供燃料
一、向U标记的PDAC细胞中添加丙氨酸-13C-葡萄糖显著增加未标记的柠檬酸盐，相应减少标记的（M2）柠檬酸盐。A类t吨-进行试验***P（P）=0.0009, *P（P）=0.0169.b–c类，丙氨酸对从头开始棕榈酸游离脂肪酸的生物合成(b)和硬脂酸盐(c（c）)在两个PDAC细胞系中。这些数据的同位素总和如图2g，h.d–g所示。丙氨酸添加到标有U的PDAC细胞-13葡萄糖减少8988T棕榈酸中葡萄糖碳的掺入(d日)和Tu8902(e（电子）)细胞以及8988T中的硬脂酸盐(（f）)和Tu8902(克)PDAC细胞。这表现为高浓缩物（棕榈酸盐M14、M16，硬脂酸盐M16、M18）减少，低浓缩物（棕榈酸酯M6、M8、M10，硬脂酸酯M6、M10、M12）增加。小时，U-13C-葡萄糖示踪研究表明，丙氨酸将葡萄糖碳引入丝氨酸生物合成途径，如全标记（M3）、葡萄糖衍生的3-磷酸甘油酯（3PG）、3-磷酸（p-Ser）、丝氨酸（Ser）和M2甘氨酸的显著增加所示。A类t吨-进行试验*P（P）3PG（Ala）与对照组的比值为0.0355***P（P）相对于对照，p-Ser（Ala）为0.0041*P（P）=0.0172，对于Ser（Ala）与对照*P（P）=0.0123甘氨酸（Ala）与对照。我,j个丙氨酸增加丝氨酸生物合成途径的活性，如前体3PG和p-Ser的变化所示。在低葡萄糖（0.5 mM）条件下生长的细胞中，这种作用增强(j个). A类t吨-进行试验；我*P（P）=0.0355, ***P（P）=0.0041;j个, ***P（P）=0.0005，3PG Ala与模拟，P（P）pSer-Ala与mock相比<0.0001。k个,我，丙氨酸改变谷氨酰胺碳对TCA循环的贡献，如U-13在8988T中添加1 mM丙氨酸后，TCA代谢物柠檬酸、异柠檬酸、富马酸和苹果酸的C-Gln衍生分数标记(k个)和Tu8902(我)PDAC细胞系。数据以相对代谢物的形式表示一，%标签b–g，k,我和总离子电流h–j小时。误差条表示n个=3 (a、 小时–升)和n个=4 (b–g)从各个井独立制备的样品中进行技术复制。的原始数据k个,我如补充信息图2k，l所示。
扩展数据图7
扩展数据图7。星状细胞自噬是通过分泌丙氨酸支持PDAC细胞代谢所必需的
一，LC3-II免疫染色的PSCs在标准培养条件下显示基本的自噬，如LC3点（绿色）所示。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b，使用LC3串联荧光（GFP–RFP）报告基因的对照（shGFP）或自噬受损（shATG5和shATG7）PSC中自噬点的代表性图像。击倒自动液位计5或自动液位计7显著减少自噬体的形成。c（c），PSC自噬的量化。误差条表示n个=13（对于shGFP）；n个=12，对于shATG5#1、shATG7#1和#2；n个=10，对于shATG5#2。双向方差分析：**P（P）=0.0067，对于shGFP与shATG5#1***P（P）=0.0009，对于shGFP与shATG5#2***P（P）shGFP与shATG7#1或#2相比<0.0001。d日PDAC-条件培养基增加hPSC细胞的自噬，如LC3串联荧光（GFP–RFP）报告所示。自溶体和自噬体（分别为红色和黄色斑点）的相对丰度是流量的度量；数据量化如图3c所示。e（电子）,（f），Western blot显示击倒自动液位计5和自动液位计7在hPSC#1中使用两个独立的shRNA(e（电子）)和hPSC#2(（f）). LC3-II（低带）的减少表明自噬减少。克，通过抑制PSC自噬自动液位计5或自动液位计7敲除减弱PSC-（hPSC#2）条件培养基增加PDAC OCR的能力。误差条表示代表性实验（共3个实验）中四个重复井的标准差。单向方差分析***P（P）=0.0006.小时，通过抑制PSC自噬自动液位计5或自动液位计7敲除减弱了PSC-（hPSC#1）条件培养基在无血清条件下增加PDAC OCR的能力，这种表型可以通过添加1 mM外源性丙氨酸来挽救。数据被归一化为用无血清DMEM处理的细胞。误差条表示n个8988T、1mM Ala、shGFP组=4；n个在独立实验中，shATG5#2、shATG7#1、shATG5#2+Ala、shATG 7#1+Ala和shGFP+Ala组为3。单向方差分析***P（P）=0.0004（对照组）vs 1 mM Ala，P（P）=0.0003，对照组对hPSC，P（P）对照组与hPSC shATG5#2+Ala组的差异小于0.0001，P（P）对照组相对于hPSC shATG7#1+Ala为0.0002，P（P）对照组与hPSC+Ala相比<0.0001。我,自动液位计5或自动液位计7与shGFP对照组相比，hPSCs敲除降低了细胞内丙氨酸浓度。误差线，s.d.ofn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。单向方差分析：***P（P）=0.0020，针对hPSC-shGFP与hPSC-sh ATG5；P（P）hPSC-shGFP与hPSC-shATG7的比值为0.0040。j个，在无血清条件下，自动液位计5或自动液位计7与shGFP对照组相比，hPSCs敲除也会减少丙氨酸的分泌。误差条表示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。t吨-测试*P（P）hPSC对hPSC-shATG5=0.0428，P（P）hPSC与hPSC-shATG7的比值为0.0477。k–m（千米），自噬抑制自动液位计5或自动液位计7击倒(e（电子）,（f）,我)或氯喹（CQ）处理（10μM）降低hPSC#2条件培养基中的丙氨酸水平(k个)和鼠标PSC(米)与shGFP或模拟处理控件相比。误差条代表的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。t吨-测试；k个, *P（P）=0.0213，对于shGFP与shATG7，P（P）=0.02061，对于shGFP与CQ；米, ***P（P）对于shGFP与shATG5，<0.0001，P（P）=0.0003，对于shGFP与shATG7，P（P）=0.0001，对于shGFP与CQ。n个自噬抑制对PSC增殖影响不大。数据绘制为以任意单位（a.u.）表示的相对细胞增殖。代表性实验（共4个实验）中4个独立井的误差线。单向方差分析；P（P）最后一个时间点的值如下：*P（P）相对于shATG5#1，shGFP为0.0103*P（P）shGFP与shATG5#2的比值为0.0124，P（P）=0.6657，对于shGFP与shATG7#1***P（P）对于shGFP和shATG7#2，<0.0001。o（o）,第页，自噬抑制对hPSC没有显著影响(o（o）)或mPSC(第页)在无血清条件下生长48h后的存活率，如锥虫蓝排斥试验所示。误差条表示的s.e.mn个=3个独立实验。
扩展数据图8
扩展数据图8。在营养限制条件下，星形细胞代谢物的分泌可以支持PDAC的生长
一hPSC条件培养基对8988T细胞在完全培养基（25 mM葡萄糖，4 mM Gln，10%血清）中的增殖无明显影响。补充丙氨酸对PDAC在完全培养基中的生长有一定的促进作用。误差条表示代表性实验（共4个实验）中6个重复井的标准差。单向方差分析**P（P）=0.0079.b,c（c）、hPSC#2或hPSC#3-条件培养基可以维持在体外8988T增殖48小时(b)和Tu8902(c（c）)细胞，与PDAC条件培养基相比。将数据归一化为无血清DMEM中的生长，并将完整血清培养基作为阳性对照。误差条表示的s.e.mn个=4个实验b和代表性实验（共3个实验）中四个重复井的s.dc（c）.单向方差分析；b, ***P（P）< 0.0001;c（c）, **P（P）=0.0091, ***P（P）< 0.0001.d日hPSC条件培养基有助于在低葡萄糖（0.5 mM）培养基中生长的8988T细胞的增殖。自噬被抑制的hPSC条件培养基失去支持PDAC生长的能力。在低葡萄糖条件下，添加外源性丙氨酸的培养基以类似于阳性对照10 mM含葡萄糖培养基的方式挽救PDAC增殖。误差条表示4个独立实验的s.e.m。单向方差分析*P（P）相对于对照，GFP为0.0420，P（P）相对于对照，完全培养基为0.0158**P（P）=0.0054.e–g，hPSC#1条件培养基增加MiaPaCa2的PDAC增殖(e（电子）)，图8902(（f）)和8988T(克)无血清培养基中的细胞。抑制自噬的hPSCs条件培养基对维持PDAC增殖的效果较差。丙氨酸可在无血清条件下促进PDAC增殖，并可挽救自噬缺陷hPSC条件培养基的增殖诱导能力(克). 添加10%的血清作为阳性对照。误差条表示8个独立实验的s.e.me（电子）,（f）和3个独立实验克.单向方差分析；e（电子）, ***P（P）=0.0011，对于shGFP与对照***P（P）=0.0013，1 mM丙氨酸与对照***P（P）=0.0001，对于完全介质与对照；（f）, ***P（P）=0.0007，对于shGFP与对照**P（P）=0.0042，丙氨酸与对照***P（P）与对照组相比，完全培养基<0.0001；克, ***P（P）< 0.0001.小时,我，小鼠PSC条件培养基促进8988T细胞增殖(小时)和MiaPaCa2(我)PDAC细胞系在无血清条件下超过48小时。当从抑制自噬的小鼠PSC中收集条件培养液时，这种作用会受到损害。误差条表示的s.e.mn个=3个实验。单向方差分析；小时, ***P（P）=0.0002，对于shGFP与对照***P（P）与对照组相比，完全培养基<0.0001；我*P（P）=0.0108, ***P（P）=0.0002.j–l在低血糖（0.5 mM）条件下，1 mM丙氨酸或丙酮酸可挽救PDAC增殖，但8988T中1 mM乳酸不能挽救PDAC增生(j个)，图8902(k个)和MiaPaCa2(我)PDAC细胞系。误差条表示代表性实验（共4个实验）中四个重复井的标准差。单向方差分析；j个, ***P（P）=0.0013, **P（P）=0.0085，1 mM丙氨酸与对照，P（P）=0.0070（10 mM葡萄糖与对照组）；k个, *P（P）=0.0323（1 mM丙氨酸与对照）***P（P）=0.0044，1 mM丙酮酸与对照***P（P）=0.0010（10mM葡萄糖与对照组）；我, **P（P）=0.0060，1 mM丙氨酸与对照***P（P）=0.0008，1 mM丙酮酸与对照***P（P）=0.0018（10 mM葡萄糖培养基与对照组）。米与对照shGFP或GPT2缺失细胞相比，在无血清培养基中培养的8988T PDAC细胞在hPSC条件培养基或丙氨酸作用下不会增殖。数据表示为48小时内的折叠式变化，完整介质作为阳性对照。误差条表示3个独立实验的标准误差。双向方差分析；对于shGFP***P（P）<0.0001，对照组与hPSC#1***P（P）=0.0060，对照组对丙氨酸***P（P）<0.0001（对照组与完全培养基）；对于shGPT1#1***P（P）= 0.0005; 对于shGPT1#2***P（P）< 0.0001, *P（P）= 0.0493; 对于shGPT2#1***P（P）< 0.0001; 对于shGPT2#2***P（P）=0.0004，对照组与hPSC#1***P（P）其他<0.0001。
扩展数据图9
扩展数据图9。具有自噬能力的胰腺星状细胞支持皮下PDAC异种移植物肿瘤生长
一，免疫印迹自动液位计5和自动液位计7皮下联合注射前感染hPSC#1细胞的敲除。LC3-II显示这些细胞中的自噬受到抑制。bhPSCs与8988T PDAC细胞联合注射后，肿瘤生长增强。在肿瘤生长的初始阶段，当hPSC中的自噬被抑制时，这种影响会显著减弱。误差条表示每个时间点每种情况下10个肿瘤的s.e.m。t吨-对每个时间点进行测试*P（P）< 0.05.c–e类注射后25天分析表明，MiaPaCa-2 PDAC细胞与PSC共注射可显著促进早期肿瘤生长(c（c）)并降低无肿瘤生存率(d日). 当PSC中的自噬被抑制时，这种效应显著减弱。e（电子），肿瘤生长动力学。误差条表示每个时间点每种情况下10个肿瘤的标准偏差，但PSC-shGFP对照组除外，该对照组只注射了5只动物。c（c），单向方差分析**P（P）=0.0099, ***P（P）=0.0020;d日，log-rank-Mantel-Cox测试*P（P）=0.0450, **P（P）=0.00174, ***P（P）< 0.0001;e（电子）,t吨-每个时间点的测试*P（P）< 0.05.（f），用三色（顶部，蓝色）或α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）（底部，棕色）染色的每个实验组肿瘤的代表性终点分析部分。肿瘤内残留的胶原蛋白沉积和基质含量保持在最低限度。αSMA染色图像中的星号表示血管，并作为阳性对照。g–i类在裸鼠侧翼联合注射RFP标记hPSCs的MiaPaCa2细胞的早期时间点分析；注射后2周肿瘤被切除。克，用mCherry（注射PSC的谱系标签）染色的肿瘤代表性切片，说明即使在早期，基质含量也很低。小时RFP免疫印迹定量作为剩余注射RFP标记星状细胞的标记物。对来自与对照shGFP-hPSCs共同注射的MiaPaCa2细胞的四个肿瘤、来自与shATG5-hPSCs共同注射的miaPaCa1细胞的三个肿瘤以及来自与shATAG7-hPSC共同注射的两个MiaPaCal2细胞的肿瘤进行了量化。如图所示，误差条表示每个条件量化的2-4车道的标准偏差。t吨-测试；不另说明。，P（P）=0.5982，对于shGFP与shATG5，P（P）>shGFP与shATG7的比值为0.9999。我RFP免疫印迹作为剩余注射RFP标记星状细胞的标记物。量化显示在小时包含所有九个样品的全印迹如补充图1e所示。
扩展数据图10
扩展数据图10。自噬能力强的胰腺星状细胞支持原位PDAC异种移植瘤生长
一，裸鼠胰腺内注射MiaPaCa2细胞或对照组shGFP或自噬受损shATG5或shATG7 hPSC 4周后的典型高分辨率超声图像。仅注射hPSC作为阴性对照。皮肤和脾脏（Sp）表示为空间参考；肿瘤轮廓为红色；在成像时未达到阈值的预期肿瘤用橙色表示。b,c（c），注射后21天，将MiaPaCa-2 PDAC细胞与PSCs共同注射到裸鼠胰腺中可显著促进早期肿瘤生长(b)降低无瘤生存率(c（c）)在这个原位异种移植模型中。同样，当PSC中的自噬被抑制时，这种作用会显著减弱。误差条，每个条件下每个时间点5个肿瘤的s.e.m。b，单向方差分析*P（P）=0.0283, ***P（P）=0.0010;c（c）log-rank-Mantel-Cox检验*P（P）=0.0278，针对MiaPaCa2+hPSC#1-shGFP与MiaPaCal2+hPS#1-shATG5*P（P）=0.0288, ***P（P）=0.0017，针对MiaPaCa2+hPSC#1-shGFP与MiaPaCal2。d日联合注射MiaPaCa2 PDAC细胞和hPSCs后的肿瘤生长动力学显示肿瘤生长增强。在肿瘤生长的初始阶段，当hPSC中的自噬被抑制时，这种影响会显著减弱。误差条表示每个时间点每种情况下测量的5只动物的肿瘤s.e.m。t吨-每个时间点的测试*P（P）< 0.05.e（电子）注射后5周肿瘤的代表性终点切片用αSMA、PSCs标记物和谱系标签mCherry染色。总之，这些污渍表明，基质含量在终点处保持最低。
图1
图1。胰腺星状细胞分泌的代谢物刺激胰腺癌代谢
一与用PDAC CM（红线）或对照（含10%血清的DMEM，黑线）处理的细胞相比，来自hPSCs的条件培养基（CM）可增加PDAC OCR（绿线）。线粒体应激试验期间OCR变化的代表性痕迹。误差条描述了6个独立实验代表性追踪中6个独立井的s.d.（如b).b，与用标准培养基处理的898T细胞相比，用来自不同细胞系的条件培养基处理的898T细胞的基础OCR的百分比变化。误差条描述了合并独立实验的s.e.m(n个=3，对于初级hPSC#1、#2、初级mPSC；n个对于hPSC#2、IMR90和MiaPaCa2，=4；n个=6（对于8988T，hPSC#1）。c（c），在100°C下加热15分钟后，PSC调节介质的OCR活性保持不变。独立实验的误差条形图(n个=4).d日，在PSC条件培养基中显著升高的代谢物，在双重条件培养基（将PSC-条件培养基添加到8988T细胞中，然后收集）中降低的代谢品，以及在经PSC-调节培养基处理的PDAC细胞中细胞内升高的代谢物。误差线，s.d(n个=3).e（电子），NEAAs（1 mM丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸）混合物或丙氨酸单独增加PDAC OCR。将数据归一化为用标准培养基处理的细胞。独立实验的误差条(n个=4).（f），使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定条件培养基样品中丙氨酸的浓度。误差线，s.d(n个=3). 用单因素方差分析确定显著性b,c（c）,e（电子）;t吨-在中测试d日,（f）.面板d日,（f）,n个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 计算的P（P）值和比较在补充信息中报告。
图2
图2。丙氨酸由星状细胞分泌，并被PDAC用于促进生物合成反应
一，丙氨酸转氨酶（GPT1/2）在中枢碳代谢中的作用。葡萄糖（Glc）、丙酮酸（Pyr）、乳酸（Lac）、Ac-CoA、柠檬酸（Cit）和α-酮戊二酸（αKG）。b，击倒通用条款1或GPT2项目经PSC条件培养基处理后，PDAC细胞内的丙氨酸进一步增加。误差线表示s.d(n个= 3). 将数据归一化为每个shRNA用标准培养基处理的细胞。c（c），击倒通用条款1或GPT2项目在PDAC细胞中，PSC条件培养基增加OCR的能力显著减弱。数据标准化为用标准培养基处理的细胞。误差条描述了独立实验的s.e.m(n个=3).d日丙氨酸处理PDAC细胞以剂量依赖的方式增加OCR，并可被丙酮酸重复。数据标准化为用标准培养基处理的细胞。误差条描述了代表性实验（共3个实验）中4个独立井的标准差。e（电子）经U处理的PDAC细胞代谢物的丙氨酸衍生碳标记模式-13C-Ala显示，在TCA循环代谢物柠檬酸盐、异柠檬酸盐（Iso）、苹果酸（Mal）和富马酸（Fum）中有大量标记掺入。误差线表示s.d(n个=3).（f），U-13PDAC细胞系中柠檬酸的C-丙氨酸标记表示为柠檬酸与标记碳的分数。误差线表示s.d(n个=3).克,小时，U-13C-Ala标记的PDAC细胞显示丙氨酸大量掺入从头开始棕榈酸脂肪酸的生物合成(克)和硬脂酸盐(小时). 数据表示为包含丙氨酸衍生标签的所有同位素的总和。误差线表示s.d(n个= 4). 用单因素方差分析确定显著性b–d段.面板b,（f）,n个=3; 面板克,小时,n个=4份来自独立井的独立制备样品的技术副本*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 计算的P（P）值和比较在补充信息中报告。
图3
图3。丙氨酸分泌依赖于星状细胞自噬
一，使用LC3串联荧光（GFP–RFP）报告器的PSC基础自噬通量的代表性图像。PDAC细胞没有荧光标记，用星号表示。b与多个PDAC株共培养后，PSC中的自噬增加，表现为自溶体增加。误差条，s.e.m.ofn个仅hPSC为32；n个8988T共培养=38；n个Tu8902共培养=41；n个MiaPaCa2共培养=24，来自3个独立实验。c（c），用来自PDAC系的条件培养基处理的星状细胞中自噬流量的定量。误差条，s.e.m.，共n个=65 hPSC调节介质；n个=50 8988T条件培养基；n个=61 Tu8902条件培养基；n个=62 MiaPaca2-条件培养基，每种条件下，独立hPSC细胞中的培养基来自3个独立实验。d日，通过抑制PSC自噬自动液位计5或自动液位计7敲除减弱PSC条件培养基提高8988T PDAC细胞OCR的能力。数据标准化为用标准培养基处理的细胞。误差条显示了集合实验的标准误差(n个=ATG7#1、#2为6；n个对于shGFP，=5，8988T条件培养基；n个=ATG5#1、#2）。e（电子）PSC条件培养基中含有升高的丙氨酸，当自噬被抑制时，丙氨酸显著降低。（f），经PSC条件培养液处理的PDAC细胞显示胞内丙氨酸升高，当PSC自噬被抑制时，这种升高被显著抑制。的错误栏e（电子）,（f），显示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。用双向方差分析确定显著性b,c（c）; 单向方差分析d–f日. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 计算的P（P）值和比较在补充信息中报告。
图4
图4。星形细胞代谢物的分泌支持PDAC在营养限制条件下的生长，并促进肿瘤生长
一PSC条件培养基可促进无血清培养基中生长的8988T细胞的增殖，这一特征与外源性丙氨酸补充有关。相比之下，PSC中抑制自噬的条件培养基不能支持PDAC生长。添加10%的血清作为阳性对照。误差线，s.e.m(n个=7）独立实验。b,c（c），注射后35天分析，8988T PDAC细胞与PSC共注射可显著促进早期肿瘤生长(b)，并降低无瘤生存率(c（c）)在异种移植模型中。当PSC中的自噬被抑制时，这种效应显著减弱。误差线，s.e.m(n个=10）每个时间点每种情况的肿瘤数，PSC–shGFP对照除外，其中(n个=5）注射动物。d日,e（电子）在同基因小鼠的胰腺中共同注射诱导型KRAS小鼠PDAC细胞和mPSC可显著增强注射后7天的早期肿瘤生长(d日)降低无瘤生存率(e（电子）)在原位同种异体移植物模型中，当PSC中自噬被抑制时，这种效应显著减弱。误差线，s.e.m(n个=10）每个条件每个时间点的肿瘤，mPSC–shGFP对照除外，其中(n个=5）注射动物。（f），肿瘤模型-基质代谢串扰。用单因素方差分析确定显著性一,b,d日; log-rank Mantel–考克斯测试c（c）,e（电子）. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 计算的P（P）值和比较在补充信息中报告。
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