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.2016年6月28日；113（26）：E3773-81。
doi:10.1073/pnas.1604519113。 Epub 2016年6月13日。

Tau积累通过钙调神经磷酸酶介导的核CaMKIV/CREB信号失活诱导突触损伤和记忆障碍

殷亚玲 1, 迪高 1, 王亚丽 1, 王志浩 1, 王欣（Xin Wang） 1, Jinwang Ye公司 1, 吴东琴 1, 林芳 1, 桂林皮 1, 杨莹 1, 王晓川 1, 成标路 2, 叶克强 三, 王建之 4
附属公司

Tau积累通过钙调神经磷酸酶介导的核CaMKIV/CREB信号失活诱导突触损伤和记忆障碍

殷亚玲等。 美国国家科学院程序. .

摘要

野生型tau的细胞内积累是散发性阿尔茨海默病（AD）的标志，但tau诱导的突触损伤和记忆缺陷的分子机制尚不清楚。在这里，我们发现人类野生型全长τ（称为hTau）的过度表达导致记忆缺陷，并损害突触可塑性。体内和体外数据均表明，hTau积累导致核部分cAMP反应元件结合蛋白（CREB）显著去磷酸化。同时，钙依赖性蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶（CaN）上调，而钙/钙调素依赖性蛋白激酶IV（CaMKIV）被抑制。进一步研究表明，CaN活化可以使CREB和CaMKIV脱磷酸化，CaN对CREB脱磷酸化的影响不依赖于CaMKIF的抑制作用。最后，CaN的抑制减弱了hTau诱导的CREB去磷酸化，改善了突触和记忆功能。总之，这些数据表明，hTau的积累通过CaN介导的抑制核CaMKIV/CREB信号而损害突触和记忆。我们的发现不仅揭示了hTau诱导突触毒性的新机制，也为挽救tau病提供了潜在的靶点。

关键词：阿尔茨海默病；CREB；钙/钙调素依赖性激酶IV；钙调神经磷酸酶；陶。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
海马CA3区Tau积累损害学习和记忆。(A类)输注AAV-eGFP-hTau 6周后海马和扩大的CA3亚群的代表性免疫荧光成像。[比例尺：200μm(左侧)和20微米(赖特).] (B类)用人τ特异性抗体HT7进行Western blotting，证实hTau在海马CA3中的表达。(C类)在6-d学习过程中，在MWM中找到隐藏平台的逃逸延迟。(D类–F)第8天通过移除平台测量的寻找隐藏平台的逃逸延迟、目标平台交叉点以及在目标象限内花费的时间。(G公司)休息1周后，使用恐惧条件反射来测量上下文记忆：将小鼠脚部电击2秒（0.8毫安），然后进行听觉提示。24小时后，将小鼠放入同一训练室，无电击和听觉提示，用摄像机记录3分钟内的总冷冻时间。(H（H）)两小时后，通过将小鼠放回与听觉提示相同的房间中30秒，再次测量3分钟内的冷冻时间。数据表示为平均值±SEM，*P（P）< 0.05,**P（P）<0.01 vs.矢量（Vec）。
图2。
图2。
hTau的过度表达降低了脊椎密度和树突长度，同时削弱了突触传递。(A类)显示初级海马神经元脊柱密度的代表性图像（12 div）。用DsRed和eGFP-hTau（hTau）或DsRed和eGFP（Vec）共转染48h，用双光子共聚焦激光扫描显微镜观察图像。（比例尺，2μm）(B类)脊柱数量的定量分析（每组至少分析来自三个独立培养物的30个神经元）。(C类和D类)用抗MAP-2探针探测初级海马神经元，用Image-pro-plus分析树突长度，每组至少分析来自三个独立培养物的30个神经元）。（比例尺，20μm）(E类)用高尔基染色法测量hTau或载体过度表达的海马CA3的脊椎密度。（比例尺，10μm）(F类)脊椎数量的定量分析（分析中使用了来自三只小鼠的至少15个神经元，每个神经元三个树突状分支）。(G公司)通过体外脑片上的全细胞电压斑贴灯记录测量sEPSC和sIPCS的代表性痕迹。(H–K型)sEPSC和sIPSC的定量分析。(L（左）)由最小刺激强度诱导的fEPSP振幅归一化的CA3-CA1中fEPSP的IO曲线。(M（M）)HFS后fEPSP的斜率，按基线标准化。箭头表示HFS的开始，记录道是LTP诱导前后五次扫描的平均fEPSP。(N个)HFS后60-80分钟测得的fEPSP相对于基线的定量分析。数据表示为平均值±SEM，*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.01,***P（P）< 0.001,****P（P）<0.0005相对于维奇。
图3。
图3。
hTau的过度表达通过上调CaN和抑制CaMKIV使核CREB失活。(A类和B类)海马神经元（7 div）感染lent-mCherry-hTau或载体并培养5天以上，然后制备细胞裂解物和核部分，用于CREB总水平和Ser133磷酸化水平的Western印迹。(C类)代表性免疫荧光成像显示HT7（绿色）探测到hTau过度表达的神经元中pCREB（红色）核染色减少。（比例尺，5μm）(D类–F)通过Western blotting检测细胞裂解液中总蛋白和pCaMKIV、总CaN-A和CaN-B以及裂解CaN-A（cCaN-A）的蛋白水平和核部分。(G公司和H（H）)免疫荧光染色检测到初级海马神经元核部分pCaMKIV降低（红色）和CaN-B增加（红色）。（比例尺，5μm）(我和J型)输注AAV-eGFP-hTau 6周后，海马CA3亚群核部分检测到CaN-A和cCaN-A、CaN-B蛋白水平升高，pCaMKIV和pCREB降低。(K（K）)用活性测定试剂盒检测原代培养海马神经元（PCHN）和小鼠海马CA3（MHCA3）的CaN活性。(L（左）——N个)细胞裂解液中的总PP2A、Leu309处的脱甲基PP2A（deML309-PP2A）、酪氨酸-307处的磷酸化PP2A，总ERK和pERK，以及通过Western blotting测定的核部分中PP1催化亚基的水平。拉明B和DAPI分别作为核标记物。数据表示为平均值±SEM，*P（P）< 0.05,**P（P）<0.01与Vec。
图S1。
图S1。
tau过度表达对CaMKII亚基的影响。海马神经元（7 div）感染lent-mCherry-hTau或载体（Vec）并培养5天以上；然后制备细胞裂解物和核部分，用于CaMKII亚单位的Western blotting分析。结果表明，总CaMKIIα、p-CaMKILα和总CaMJIIβ水平显著升高，而裂解物中CaMKIγ水平无变化(A类和C类); 在hTau过度表达后，核组分中，p-CaMKIIα显著增加，CaMKILα和β总量减少，CaMKIIγ不变(B类和C类). 数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与Vec。
图S2。
图S2。
tau过度表达对NFATc4和GSK-3β磷酸化的影响。(A类——C类)将AAV-eGFP（Vec）或AAV-eGFP-hTau（hTau）立体定向注射到2月龄小鼠的海马CA3。45天后，解剖海马CA3亚群进行蛋白质印迹或免疫沉淀分析。总NFATc4水平在裂解液中没有改变，但在核组分中显著增加，而pS9GSK-3β在裂解液和核组分的水平均降低。(D类)使用抗NFATc4免疫沉淀海马CA3提取物中的NFATc4+，并使用抗磷蛋白/苏氨酸抗体检测NFATc4-的磷酸化。hTau表达后，丝氨酸和苏氨酸残余物的NFAT4c磷酸化降低。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）与Vec相比，<0.001。
图4。
图4。
抑制CaN可以减弱hTau诱导的CREB去磷酸化，而不依赖于其对CaMKIV抑制的影响。(A–D)将原代海马神经元（7 div）用香菇-樱桃-hTau或载体感染，培养5天后，用1μM FK506或50 nM CsA处理12 h，然后用Western blotting检测pS133-CREB和pS196-CaMKIV水平。(E类和F类)用hTau和CaMKBP4或CaMKIVK75E质粒共转染N2A细胞48 h，用1μM FK506处理12 h，然后用Western blotting检测核部分CREB的磷酸化水平。数据表示为平均值±SEM*P（P）与Vec相比<0.05；#P（P）<0.05 vs.hTau；和&P（P）<0.05 vs.hTau+CaMKBP4；$P（P）<0.05 vs.hTau加CaMKIVK75E。
图S3。
图S3。
FK506同时抑制CaN可减弱hTau诱导的GSK-3β和NFATc4去磷酸化。将AAV-eGFP（Vec）或AAV-eGFP-hTau（hTau）立体定向注射到2月龄小鼠的海马CA3。45天后，腹腔注射FK506（10 mg·kg·d）或溶媒1周。然后解剖海马CA3亚群进行Western blotting(A类). 定量分析表明，同时抑制CaN可提高pS9GSK-3β水平(C类)GSK-3β总量增加(D类)NFATc4略有下降(B类)在核分数中。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001 vs.Vec；#P（P）< 0.05,##P（P）<0.01 vs.hTau。
图5。
图5。
抑制CaN可以通过改善树突状可塑性和突触功能来挽救hTau诱导的记忆缺陷。(A类)示意图显示了处理方法。将AAV-eGFP（Vec）或AAV-eGFP-hTau（hTau）立体定向注射到2月龄小鼠的海马CA3。45天后，腹腔注射FK506（10 mg·kg·d）或溶媒1周。然后检测认知行为和突触可塑性。(B类)在MWM测试的6天学习过程中，寻找隐藏平台的逃避潜伏期。(C类)在第8天通过移除隐藏平台进行的记忆测试中，代表性的游泳轨迹。(D类和E类)在第8天测试了找到平台和目标平台交叉点的逃逸延迟。(F类和G公司)在最后一次MWM任务后1周，使用恐惧条件反射来测量小鼠的上下文记忆。(H（H）)FK506或溶媒治疗后，通过体外脑片上的全细胞电压斑贴灯记录到sEPSC和sIPCS的代表性痕迹。(我)每组至少采集12个神经元的sEPSC或sIPSC的平均频率和振幅。（比例尺，10 pA，1秒）(J型)fEPSP的IO曲线记录在过度表达hTau或载体的急性海马脑片上，并用FK506或载体处理(n个=每组6人）。(K（K）)FK506或载体治疗后海马脑片记录HFS后fEPSP斜率(n个=每组6人）。箭头表示HFS发病，显示了LTP诱导前后EPSP的平均轨迹。(L（左）)HFS后60-80分钟对归一化fEPSP进行定量分析。(M（M）和N个)高尔基染色观察海马CA3亚群的脊柱密度。数据表示为平均值±SEM，*P（P）< 0.05,**P（P）<0.01，Vec vs.hTau；#P（P）< 0.05,##P（P）<0.01，hTau vs.hTau加FK506。
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