Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity

doi:10.7554/eLife.12727

.2016年3月24日5:5:e12727。

doi:10.7554/eLife.12727。

用于神经活动成像的敏感红蛋白钙指示剂

附属公司

¹美国阿什本霍华德休斯医学院Janelia研究院。
²以色列Rehovot魏兹曼科学研究所。
^三美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学院。

PMID： 27011354
预防性维修识别码：项目经理4846379
内政部： 10.7554/寿命12727

用于神经活动成像的敏感红蛋白钙指示剂

霍德·达纳等。埃利夫. 2016.

.2016年3月24日5:5:e12727。

doi:10.7554/eLife.12727。

附属公司

¹美国阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院。
²以色列Rehovot魏兹曼科学研究所。
^三美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学院。

PMID： 27011354
预防性维修识别码：第846379页
内政部： 10.7554/e生活12727

摘要

基因编码的钙指示剂（GECI）可以测量大量神经元和小神经元隔室中毫秒至数月的活动。虽然基于GFP的GECI广泛用于体内神经生理学，但具有红移激发和发射光谱的GECI在体内成像方面具有优势，因为它减少了组织中的散射和吸收，从而降低了光毒性。然而，目前用于检测和量化神经活动的红色GECI不如基于GFP的GCaMP6指标。在这里，我们提出了基于mRuby（jRCaMP1a，b）和mApple（jRGECO1a）的改进的红色GECI，其灵敏度与GCaMP6相当。我们对新的红色GECI在培养的神经元和小鼠、果蝇、斑马鱼和秀丽线虫体内的表现进行了表征。红色GECI有助于深层组织成像、双色成像和基于GFP的报告员，以及将光遗传学与钙成像结合使用。

关键词：秀丽线虫；D.黑腹滨鹬；GECI；钙显像；荧光探针；小鼠；神经科学；蛋白质工程；斑马鱼。

PubMed免责声明

利益冲突声明

其他作者声明，不存在相互竞争的利益。

ERS:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。

LLL:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。

KS:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。

DSK:DSK、ERS、LLL和KS已就与红色GECI变体相关的材料和方法申请专利（申请号US 14/974483）。

数字

图1。 — **图1.分离神经元中jRCaMP1和jRGECO1的突变和筛选。**
(一)RCaMP1h和R-GECO1结构以及在jRCaMP1a、jRCaMP 1b和jRGECO1a中引入的突变。M13肽（黄色）、连接器1（灰色）、cpmRuby或cpmApple（红色）、连接器2（灰色）和CaM（蓝色）。jRCaMP1a（绿色）、jRCaMP 1b（青色）、jRGECO1a（绿）的突变位置。(b条)培养神经元分析示意图。场电极（灰色，上图）刺激表达胞质红色GECI变体和细胞核GFP的培养神经元。记录并分析荧光变化（下面板）。给出了jRGECO1a表达神经元在3动作电位（AP）刺激后的反应轨迹示例。(c)855个R-GECO1变异体的筛查结果。顶部，响应1个动作电位的荧光变化（垂直条，ΔF/F₀振幅；黑条、单个R-GECO1突变和组合突变；红色条，R-CaMP2左侧，jRGECO1a右侧）。中间，不同AP刺激的显著性值（彩色图）。10次AP后的底部一半衰减时间。黑线表示R-GECO1性能水平。(d日)1070个RCaMP1h变异体的筛查结果。顶部，荧光变化响应1个AP（顺序与中相同b条; 红色条，R-CaMP2左侧，jRCaMP1a和jRCaMP 1b右侧）。中间，不同AP刺激的显著性值（彩色图）。10次AP后的底部一半衰减时间。黑线表示RCaMP1h性能水平。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.003

图2。 — **图2.jRGECO1和jRCaMP1在分离神经元中的表现。**
(一)RCaMP1h（9479个神经元，605孔）、R-GECO1（8988个神经元，539孔）、R-CaMP2（265个神经元，22孔）、jRGECO1a（383个神经元，26孔）、JRCaMP1（599个神经元，38孔）和jRCaMPlb（641个神经元，31孔）对一个动作电位的平均反应。(b条)10个AP响应相同。(**c–f**)比较jRGECO1和jRCaMP1传感器以及其他红色GECI，作为AP数量的函数（颜色代码如一). (c)响应幅度，ΔF/F₀. (d日)信噪比SNR，定义为基线以上的荧光信号峰值除以刺激前的信号标准偏差。(**e（电子）**)衰减时间减半。(**（f）**)一半上升时间。误差线对应于s.e.m（n=605口井，RCaMP1h；539，R-GECO1；22，R-CaMP2；38，jRCaMP1a；31，jRCa MP1b；26，jRGECO1a）。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.004

图2——图补充1。 — **图2-图补充1.红色GECI的吸收和发射光谱。**
(一)jRGECO1a（左面板）、jRCaMP1a（中）和jRCaMP 1b（右）在无Ca（蓝线）和饱和Ca（红线）状态下的单光子激发（虚线）和发射（实线）光谱。(b条)jRGECO1a、jRCaMP1a和jRCaMP 1b在无钙（蓝色）和钙饱和（红色）状态下的双光子激发光谱。绿色虚线表示这两种状态之间的比例。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.006

图2——图补充2。 — **图2-图补充2.生物物理特性。**
(一)红色GECI和红色FP（均为1070 nm）和GCaMP6（940 nm）的荧光量子产率。(b条)红色GECI、红色FP和GCaMP6的峰值双光子分子亮度（GECI的钙束缚态）（注意使用的不同波长）。mApple数据输入一和b条摘自Akerboom等人，2013年。在纯化蛋白质分析中进行测量（材料和方法）。(**c–d码**)无钙条件下jRGECO1a（蓝色）、jRCaMP1a（黑色）和jRCaMP 1b（红色）的单光子漂白曲线(c)和钙饱和(d日)状态。请注意，无钙jRGECO1a漂白可以忽略不计，而约40%的钙饱和jRGECO_1a分子在几秒钟内即可进行光漂白。**e–g**jRCaMP1a的双光子漂白曲线(**e（电子）**)，jRGECO1a(**（f）**)和GCaMP6(克)处于无钙和钙饱和状态。**h–i**，饱和钙jRCaMP1a的双光子漂白曲线(小时)和jRGECO1a(我)在保持相同信噪比的情况下，用两种不同的波长激发时。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.007

图2——补充图3。 — **图2——图补充3：纯化蛋白质分析中的光开关。**
纯化Ca的荧光痕迹²⁺-jRCaMP1a（左面板）、jRGECO1a（中面板）和R-CaMP2（右面板）的游离蛋白液滴（红色痕迹）用561 nm激发光（40 mW/mm）持续照射²)，488 nm光脉冲（3.2 mW/mm²峰值功率、50 ms持续时间、0.2 Hz、1 Hz和1.8 Hz，分别位于上、中、下行）。对于基于mApple的GECI、jRGECO1a和R-CaMP2，蓝色照明诱导荧光强度的短暂、钙非依赖性增加，表明存在光开关，而jRCaMP1a不具有光开关，但具有光漂白作用。**内政部：** 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.008

图2——图补充4。 — **图2：补充图4。jRCaMP1a与jRGECO1a相比，与ChR2同时使用更兼容。**
(一)经蓝光（33 mW，10 ms脉冲，83 Hz，200μm X 200μm FOV；材料和方法）刺激脉冲（浅蓝色条）刺激后，单独转染jRGECO1a（灰色）或jRGECO3a+ChR2-Venus（蓝色）的培养大鼠海马神经元发出的荧光信号。插图，表达jRGECO1a（红色）和ChR2-Venus（绿色）的神经元的合并图像。(b条)与中的实验相同一培养的神经元单独表达jRCaMP1a（灰色）或jRCaMP 1a+ChR2-Venus（黑色）。(c)峰值ΔF/F₀表达jRGECO1a+ChR2 Venus的5个神经元（蓝色）和单独表达jRGECO1a的5个神经元（灰色）的值作为蓝色刺激光功率的函数。(d日)峰值ΔF/F₀5个神经元表达jRCaMP1a+ChR2-Venus（黑色），5个神经元单独表达jRCa MP1a（灰色），作为蓝色刺激光功率的函数。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.009

图3。 — **图3：jRGECO1a、jRCaMP1a和jRCaMP 1b在小鼠初级视觉皮层中的表现。**
(一)上图，实验示意图。底部，表达jRGECO1a的V1 L2/3细胞图像（左），以及根据神经元的首选方向（色调）和响应幅度（亮度）进行彩色编码的相同视野。(b条)表达jRGECO1a（左）和jRCaMP1a（右）的三个L2/3神经元的踪迹示例。叠加单个试验（灰色）和5个试验的平均值（jRGECO1a和jRCaMP1a分别为蓝色和黑色）。八个光栅运动方向由箭头指示，如上图所示。首选的刺激是引起最大反应的方向。jRGECO1a记录道与面板中指示的单元格相对应一（另请参阅视频1）。(c)神经元对其首选刺激的平均反应（175个细胞，R-GECO1；310，R-CaMP2；395，jRGECO1a；347，jRCaMP1a；95，jRCa MP1b。对于jRGECOIa和jRCaMP 1a，n=4只小鼠，对于所有其他结构，n=3只小鼠。面板c-f基于相同的数据集(d日)用RCaMP1h、R-GECO1、R-CaMP2、jRGECaMP1a、jRCaMPlb和jRGECO1a转导的1 Hz漂移光栅驱动的神经元的傅里叶谱归一化为0 Hz振幅。1 Hz响应振幅的插入放大视图。(**e（电子）**)当表达不同的钙指标时，检测到对视觉刺激有反应的细胞分数（ANOVA测试，p<0.01）。与RCaMP1h相比，jRCaMP1a和jRCaMP 1b的这一分数分别高出8倍和6倍，与R-GECO1相比，jRGECO1a的这一比例高出60%（Wilcoxon秩和检验；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001）。误差条对应于s.e.m（26个视场，RCaMP1h；45，jRCaMP1a；31，jRCa MP1b；30，R-GECO1；40，jRGECO1a；33，R-CaMP2；23，GCaMP6s；29，GCaMP 6f）(**（f）**)首选刺激的ΔF/F振幅分布。右移曲线，如jRGECO1a vs.R-GECO1或jRCaMP1a/b vs.jRCaMP 1h，表明响应幅度增强（jRCaMPa 1a和jRCa MP1b vs.RCaMP1的75个百分位值分别为0.36和0.27 vs.0.18，jRGECO3a vs.GCaMP6f的0.66 vs.0.38）。（1210个细胞，R-GECO1；861，RCaMP1h；1733，R-CaMP2；1605，jRGECO1a；1981，jRCaMP1a；971，jRCaMP1b；907，GCaMP6f；672，GCaMP6s），与**e（电子）**.内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.010

图3——图补充1。 — **图3补充1。用不同的红色GECI测量V1神经元的方向调谐比较。**
检测为响应的所有细胞的定向选择性指数分布（OSI，上面3行），使用不同的GECI测量。底部面板，所有结构的平均值±s.d显示出类似的调谐特性（n=238个单元，R-GECO1；308，jRGECO1a；386，R-CaMP2；277，jRCaMP1a；141，jRCa MP1b；337，GCaMP6s；203，GCaMP 6f）。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.011

图3——图补充2。 — **图3补充图2。小鼠V1中红色GECI的长期表达。**
(一)长期表达红色GECI后V1 L2/3神经元的示例图像。(b条)比较反应细胞、定向调节细胞的比例以及它们之间的比率。每个时间点对应不同的鼠标。(c)ΔF/F峰值分布₀不同动物在不同时间表达红色GECI后成像。表达时间对峰值反应无明显影响。(d日)具有不同表达时间的红色GECI的不同动物的荧光反应半衰减时间。表达时间对衰变动力学没有明显影响。jRCaMP1a表达16天的数据未显示，因为符合此分析条件的细胞数量太少（材料和方法）。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.012

图4。 — **图4：小鼠视觉皮层的联合成像和电生理学。**
(一)同时从表达jRGECO1a（顶部，蓝色）和jRCaMP1a（底部，黑色）的神经元测量荧光动力学和峰值。每个脉冲的峰值数量显示在轨迹下方（单个峰值用星号表示）。左插图，一个用记录吸管（绿色）表达jRCaMP1a的神经元。(b条)根据动作电位爆发进行缩放（对应于中的方框一). 顶部，jRGECO1a；底部，jRCaMP1a。(c)jRGECO1a荧光变化响应1个AP（顶部，来自11个细胞的199个峰，n=6只小鼠），jRCaMP1a荧光改变响应2个AP（底部，来自10个细胞的65个峰，n=5只小鼠）。蓝色（顶部）和黑色（底部）线是中间记录道。(d日)峰值荧光变化的分布与一个时间段内动作电位的数量有关（jRGECO1a，蓝框：199 1AP事件；2 AP:100 ms时间段内70个事件；3 AP:29125 ms；4 AP:34150 ms；5 AP:35175 ms；6 AP:22200 ms；7 AP:14225 ms；8 AP:21250 ms。jRCaMP1a，黑框：135 1 AP事件；2个AP：65150毫秒；3个AP：71200毫秒；4个AP：52250毫秒；5个接入点：33，300毫秒；6个AP：20、350毫秒；7个AP:14350毫秒；8个AP:11350毫秒）。每个框对应第25到75个^第个分布的百分位（q₁和q_三分别），晶须长度达到极限数据点或1.5_我（问题3-问题1）。(**e（电子）**)jRGECO1a和jRCaMP1a的接收机工作特性（ROC）曲线，用于对1个和2个AP进行分类（jRGECO 1a:320个4s舱内无AP发射事件，jRCaMP 1a:274个5s舱内没有AP发射事件、1个AP和2个APs数据与d日). (**（f）**)检测灵敏度指数（d'）是一个时间段内峰值数量的函数（与中的参数相同）**d–e日**). (克)比较2 AP反应的jRGECO1a和jRCaMP1a的平均半上升（左）和衰减（右）时间。误差条对应于s.e.m。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.014

图4——图补充1。 — **图4：图补充1。jRGECO1a在溶酶体中积聚。**
(一)小鼠V1固定组织切片的红色GECI表达（顶部，红色）和LAMP-1免疫染色（底部，绿色）。(b条)表达jRGECO1a的神经元的蛋白质聚集体覆盖的体细胞面积部分的分布。V1（固定组织）中的神经元显示出比培养神经元更频繁的jRGECO1a聚集（Wilcoxon秩和检验，p<0.001；n=10个培养细胞；14个固定组织细胞；8个固定组织LAMP-1免疫染色细胞）。(c)显示ΔF/F的V1 L2/3电池记录道示例₀与蛋白质聚集体重叠的体细胞区域变化（红色、黑色）和不包括聚集体的区域变化（蓝色）。插图，细胞图像，用圆圈表示聚集物。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.015

图4——图补充2。 — **图4补充图2。红色GECI在900nm激发下缺乏功能响应。**
三个示例细胞（jRGECO1a，在L4 V1神经元中表达）在1040 nm激发（左）和900 nm下的功能反应（在FOV中50个细胞中检测到25个细胞对1个细胞有反应；漂移光栅刺激，材料和方法）。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.016

图4——补充图3。 — **图4补充图3。体内长期表达后红色GECI的复杂光谱和功能特征。**
(一)体内jRGECO1a（左）和jRCaMP1a（右）L2/3神经元在1040nm（上）和900nm光（下）激发下的图像。请注意底部图像中的点状荧光图像。(b条)当用900nm和1000nm激光照射时，来自jRGEC1a（顶部）和jRCaMP1b（底部）的固定组织细胞的发射光谱显示绿色发射带。(c)长期表达对绿色物种积累的影响。900 nm激发下检测到的jRGECO1a体细胞信号（红色和绿色通道之和）与1040 nm激发时检测到的基线荧光之间的比值的散射图，以及体细胞ΔF/F峰值₀用于漂移光栅刺激。在注射AAV后16（左）和132（右）天进行测量。红色实线表示线性回归模型，红色虚线表示95%的置信区间；R（右）²=0.09，对于数据集和斜率分别为-9.2和-10（n=98个单元格，左面板；n=274个单元格，右面板；线性回归模型，F检验，p<0.005）。(d日)体细胞荧光比率在900 nm和1040 nm激发之间的分布（与c)随着表达时间的延长，比率中值及其范围均增加。每个框对应第25到75个^第个分布的百分位数（q₁和q_三分别），晶须长度达到极限数据点或1.5（q3-q₁).内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.017

图5。 — **图5使用红色GECI进行深层组织成像。**
(一)左，测量示意图。在不同深度（FOVs 1-n）对L5神经元顶端树突进行成像。右，来自L5顶端树突（红点）的RCaMP1h荧光作为成像深度的函数。对于固定激发光，由于散射和吸收损失，亮度随成像深度而降低。衰减的特征是对信号拟合指数函数（实心黑线）。(b条)从表示绿色（GCaMP6s或GCaMP6 f）或红色（RCaMP1h、jRCaMP1 a和jRGECO1a）GECI的枝晶测得的指数衰减系数。红色GECI信号衰减系数显著长于绿色GECI（Wilcoxon秩和检验，p<0.0001；红色GECI有3只小鼠和19个树突；绿色GECI有2只小鼠和14个树突）。(c)L6神经元，软脑膜下850μm。一只NTSR1-cre小鼠（Gong等人，2007）感染了FLEX-SYN1-NES-jRCaMP1a AAV。(d日)来自三个示例L6神经元的示例痕迹。单次试验（灰色）和5次试验（黑色）的平均值重叠。八个光栅运动方向由箭头指示，如上图所示。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.018

图6。 — **图6：小鼠视觉皮层的双色成像。**
(一)钙饱和GCaMP6s、jRCaMP1a和jRGECO1a的双光子作用光谱。对纯化蛋白进行测量（材料和方法）。(b条)KJ18-cre小鼠L1（软脑膜下50μm）L5顶端树突（红色）和LM轴突（绿色）的图像。(c)ΔF/F₀轴突（绿色）和树突（红色）ROI的痕迹，如b条（视频2）。(d日)中虚线框对应的放大c.内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.019

图7。 — **图7.中的成像活动*果蝇属*带有红色GECI的NMJ boutouns幼虫。**
(一)的示意图*果蝇属*幼虫神经肌肉接头（NMJ）测定。当对突触前神经束中的钙反应进行光学成像时，对分割的运动神经进行电刺激（绿色箭头）。(b条)多个红色和绿色GECI对5 Hz刺激的响应瞬态（平均值±s.e.m.）（持续2 s）。jRGECO1a的反应幅度分别是GCaMP6f和GCaMP6的4倍和60%（p<10-4和p=0.01，Wilcoxon秩和检验），jRCaMP1a的响应幅度是GCaMP 6f的3倍（p=10-4），并且与GCaMP 6相似（jRGECIa的12只FOV；11只jRCaMP 1a；13只jRCa MP1b；12只GCaMP6-s；12只GC aMP6F；所有结构的n=7只苍蝇）(c)频率调谐响应的比较（峰值ΔF/F₀1、5、10、20、40、80和160 Hz刺激（2 s持续时间）下红色和绿色GECI的平均值±s.e.m.）。对于1 Hz的刺激，jRGECO1a和jRCaMP1a的反应振幅比GCaMP6s和GCaMP6高2-3倍（p<0.001，Wilcoxon秩和检验），但对于20 Hz及以上的刺激频率，则更低（jRGECO_1的12个FOV；10，R-GECO1；11，jRCaMP 1a；13，jRCa MP1b；10，RCaMP1；12，GCaMP 6f；对于R-GECO1，n=5只苍蝇；对于所有其他构造，n=7只苍蝇）(d日)160 Hz刺激下红色和绿色GECI的半衰变时间（平均值±s.e.m.）（FOV和苍蝇与c；***，p<0.001，Wilcoxon秩和检验）。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.021

图7——图补充1。 — **图7-图补充1.中的成像活动*果蝇属*NMJ幼虫与jRGECO1a混合。**
(一)实验装置示意图。外荧光和高倍率△F/F₀来自肌肉13（节段A3-A5）的1b型隆起物（绿色箭头）图像，图像分割ROI叠加（材料和方法）。(b条)R-GECO1、jRGECO1a和jRGECO_1b在1Hz刺激2s后的单次试验和平均荧光瞬变（R-GECO1:5只苍蝇中有10只FOV，40磅；jRGECOIa:7只苍蝇有12只FOVs，48磅；jRCECO1b:6只苍蝇9只FOVs36磅。所有其他分析使用相同的数据集）。jRGECO1a在*果蝇属*NMJ与斑马鱼三叉神经细胞；因此，jRGECO1b未在其他动物模型中进行充分测试。(**c–d码**)傅里叶光谱归一化为5 Hz期间采集的0 Hz荧光信号(c)和10赫兹(d日)刺激。(**e–f**)△F/F₀(**e（电子）**)和信噪比(**（f）**)用1、5、10、20、40、80和160 Hz刺激2 s记录的记录道（平均值±标准误差）（由底部的红色曲线表示，振幅不按比例）。(**g–小时**)△F/F₀(克)和信噪比(小时)用1 Hz和5 Hz刺激记录2 s的记录道（平均值±s.e.m.）（由底部的红色曲线显示，振幅不按比例）。(**i–j**)△F/F的比较₀1、5、10 Hz的R-GECO1和jRGECO1变体的迹线（平均值±s.e.m.）(我)和20、40、80赫兹(j个)刺激2s（底部红色曲线显示，振幅不按比例）。(**k–l**)调频平均峰值△F/F的比较₀(k个)和峰值信噪比(我)GCaMP6变异体、R-GECO1和jRGECO1变异体的（平均值±s.e.m.），刺激频率为1、5、10、20、40、80和160 Hz。注意，垂直轴是对数刻度。(米)40 Hz刺激下GCaMP6变异体、R-GECO1和jRGECO1变异体的动力学比较。水平轴是上升时间的一半，垂直轴是衰减时间的一半。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.025

图7——图补充2。 — **图7-图补充2.中的成像活动*果蝇属*带有jRCaMP1构造的NMJ幼虫体。**
(一)实验装置示意图。外荧光和高倍率△F/F₀来自肌肉13（节段A3-A5）的1b型隆起物（绿色箭头）图像，图像分割ROI叠加（材料和方法）。(b条)R-GECO1、jRCaMP1a和jRCaMP 1b在1Hz刺激2s后的单次试验和平均荧光瞬变（RCaMPlh:7只苍蝇中的10个FOV，40 boutons；jRCaMPa 1a:7只果蝇中的11个FOV（44 boutons）；jRCa MP1b:7只蝇中的13个FOV、52 boutons。所有其他分析使用相同的数据集）。(**c-d公司**)△F/F₀(c)和信噪比(d日)用1、5、10、20、40、80和160 Hz的刺激记录2 s的记录道（平均值±标准误差）（由底部的红色曲线显示，幅度不按比例）。(**e–f**)△F/F₀(**e（电子）**)和信噪比(**（f）**)用1和5 Hz刺激记录2 s的轨迹（平均值±s.e.m.）（底部红色曲线显示，振幅不按比例）。(**克–小时**)△F/F的比较₀1、5、10 Hz的R-GECO1和jRCaMP1变体的迹线（平均值±s.e.m.）(克)和20、40、80赫兹(小时)刺激2秒（底部红色曲线显示，振幅不按比例）。(我–j个)频率调谐平均峰值△F/F的比较₀(我)和峰值信噪比(j个)RCaMP1h和jRCaMP1变体的（平均值±s.e.m.），刺激频率为1、5、10、20、40、80和160 Hz。注意，垂直轴是对数刻度。(k个)40 Hz刺激下RCaMP1h和jRCaMP1变体的动力学比较。水平轴是上升时间的一半，垂直轴是衰减时间的一半。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.026

图7——图补充3。 — **图7-图补充件3.比较*果蝇属*NMJ幼虫发声。**
(**a–b**)1 Hz后的单次试验和平均荧光瞬态(一)和5赫兹(b条)对jRGECO1a、jRCaMP1a、JRCaMP1 b、GCaMP6和GCaMP6f刺激2秒（jRGECO 1a:7只苍蝇中的12个FOV，48磅；jRCaMP 1a:8只苍蝇的11个FOV（44磅）；jRCa MP1b:7只果蝇中的13个FOVs，52磅；GCaMP6:7只苍鹰中的12种FOVs（48磅）；GCaMP 6f:7只蝇中的十二种FOVs.所有其他分析使用相同的数据集）。(c)频率调谐平均峰值△F/F的比较₀jRGECO1a、jRCaMP1变异体和GCaMP6变异体的（平均值±s.e.m.），刺激频率为1、5、10、20、40、80和160 Hz。注意，垂直轴是对数刻度。(**d–e日**)频率调谐平均半衰减的比较(d日)和半上升(**e（电子）**)jRGECO1a、jRCaMP1变异体和GCaMP6变异体的（平均值±s.e.m.），刺激频率为1、5、10、20、40、80和160 Hz。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.027

图8。 — **图8带有红色GECI的斑马鱼三叉神经细胞的成像活动。**
(一)斑马鱼三叉神经细胞分析示意图。斑马鱼幼虫（受精后3-4天）瘫痪，包埋在琼脂糖中，并用电极刺激（20毫秒脉冲；20赫兹下的1、5和10脉冲；材料和方法）。(b条)五脉冲刺激的反应瞬态（R-GECO1的平均值±s.e.m；n=5个fish；7，jRGECO1a；6，R-CaMP2；6，RCaMP1h；7，JRCaMP1 a；6、jRCaMPb；6，GCaMP6s；6，GC aMP6f）。jRCaMP1a和jRCaMP 1b的反应幅度分别是RCaMP1的7倍和8倍，jRGECO1a的反应幅度是R-CaMP2的4倍（Wilcoxon秩和检验，p<0.01）。(c)平均峰值ΔF/F₀（与中的鱼相同b条)响应一个、五个和十个脉冲刺激。(d日)不同红色和绿色GECI的半衰变时间（10脉冲刺激，平均值±s.e.m.，与b；*，p<0.05；**，p<0.01，Wilcoxon秩和检验）。**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.028

图9。 — **图9.中的成像活动*秀丽线虫*带有红色GECI的ASH和AWC神经元。**
(一)的示意图*秀丽隐杆线虫*成像分析。瘫痪的动物被限制在微流体装置中，其鼻子暴露在流体通道中。刺激物（S）或缓冲物（B）的传递由来自控制通道C1和C2的交替侧流间接控制。(b条)ASH神经元对1s 1M高渗甘油脉冲响应的平均荧光瞬变（jRGECO1a、8、jRCaMP1a、9、jRCa MP1b、8、R-GECO1、12、R-CaMP2、9、RCaMP1 h的跨虫平均值）。(c)1s甘油脉冲信号调制的量化（所有2s周期的平均峰谷差除以缓冲区内前10s的信号平均荧光（平均值±标准偏差，与b条). 星号表示显著差异（Wilcoxon秩和检验；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001）。(d日)暴露于92µM异戊醇一分钟后，AWC神经元的平均荧光瞬变（n=19只蠕虫，针对jRGECO1a；7，jRCaMP1a；8，jRCa MP1b；15，R-GECO1；6，RcaMP1h）。Epochs 1–3在**e（电子）**和**（f）**. (**e（电子）**)第1阶段（臭气添加）、第2阶段（臭味去除）和第3阶段（恢复基线）AWC荧光变化的比较，与d日每个方框对应于第25到75个^第个分布的百分位数（q₁和q_三分别），晶须长度达到极限数据点或 $1.5_{我} ({q个}_{三} - {q个}_{1})$ （f）添加气味后AWC中的衰变率比较（第1阶段），与d日.内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.029

**作者回复图片1。**
**内政部：** http://dx.doi.org/10.7554/eLife.12727.032

**作者回复图片2。**
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[7] Akerboom J、Carreras Calderón n、Tian L、Wabnig S、Prigge M、TolöJ、Gordus A、Orger MB、Severi KE、Macklin JJ、Patel R、Pulver SR、Wardill TJ、Fischer E、Schüler C、Chen TW、Sarkisyan KS、Marvin JS、Bargmann CI、Kim DS、Kügler S、Lagnado L、Hegemann P、Gottschalk A、Schreiter ER、Looger LL。用于多色神经活动成像和与光遗传学结合的基因编码钙指示剂。分子神经科学前沿。2013;6:2. doi:10.3389/fnmol.2013.00002。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Andermann ML、Kerlin AM、Roumis DK、Glickfeld LL、Reid RC。小鼠高级视觉皮层区域的功能专门化。神经元。2011;72:1025–1039. doi:10.1016/j.neuron.2011.011.013。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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