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.2016年3月22日：7:10993。
doi:10.1038/ncomms10993。

MicroRNA-378通过抑制Gli3表达限制肝星状细胞激活和肝纤维化

Jeongeun Hyun先生 1, Sihyung Wang（王思雄） 1, 金洁云（Jieun Kim） 1, Kummara Madhusudana Rao公司 2, 苏永公园 2, 伊尔杜·钟 2, 昌锡哈 2, 金翔宇 1 三, 杨和云 4, 荣英美 1 三
附属公司

MicroRNA-378通过抑制Gli3表达限制肝星状细胞激活和肝纤维化

Jeongeun Hyun先生等。 国家通讯社. .

摘要

刺猬（Hh）信号调节肝纤维化。微小RNA（miRNA）介导各种细胞过程；然而，它们在肝纤维化中的作用尚不清楚。在这里，我们研究了miRNAs在慢性损伤的纤维化肝脏中的调控。MiRNA分析表明，与玉米-白介素处理的小鼠相比，四氯化碳（CCl4）处理的小鼠miR-378家族成员（miR-378a-3p、miR-375b和miR-377d）的表达下降。在活化的肝星状细胞（HSC）中直接靶向Gli3的miR-378a-3p的过度表达降低了Gli3和纤维化前基因的表达，但在CCl4处理的肝脏中诱导了HSC失活标记gfap。Smo通过激活核因子κB（NF-κB）的p65亚单位来阻断miR-378a-3p的转录表达。肝脏miR-378a-3p水平与人肝癌中肿瘤和非肿瘤组织中Gli3的表达呈负相关。我们的结果表明，miR-378a-3p通过靶向Gli3抑制HSC的激活，其表达受Smo依赖性NF-κB信号调节，表明miR-378-3p具有治疗肝纤维化的潜力。

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数字

图1
图1。MiR-378家族在CCl损伤肝脏中下调4-治疗小鼠。
(一)使用从玉米油（对照；CON）或CCl处理的小鼠肝脏中提取的总RNA进行miRNA表达的微阵列分析4(n个=每组3个），持续10周。热图显示了差异表达miRNA的双向层次聚类。每行和每列分别代表一个miRNA和一个条件。这一行Z轴-通过从miRNA的表达值中减去miRNA的平均表达量，然后除以所有样本的标准差，计算每个miRNA表达水平的分数缩放。颜色越接近鲜绿色，表达越低；越接近鲜红色，表达越高。(b条)CCl中显著失调的miRNAs列表4-与玉米-白细胞介素处理的肝脏（CON）相比，经处理的肝脏折叠改变P（P）-值。(c（c）)qRT-PCR用于评估miR-378家族，包括miR-378a-3p、miR-375b和miR-377d在CON-和CCl肝脏中的表达4-在6周和10周时给小鼠治疗(n个=每组4人）。绘制平均值±标准误差结果（未配对的两个样本学生的t吨-测试*P（P）<0.05与CON）。(d日)所有小鼠肝脏miR-378a-3p表达与羟脯氨酸含量的Spearman秩相关(n个=20，斯皮尔曼秩相关分析；第页，相关系数）。
图2
图2。aHSC中miR-378家族表达减少。
(一)用qRT-PCR检测miR-378家族成员，包括miR-378a-3p、miR-379b和miR-377d在HepG2（人肝上皮细胞系）和LX2（人aHSC系）细胞中的表达。(b条)从正常C57BL/6小鼠静止期（d0；分离后立即）和原代aHSC（d7；培养7天）分离的原代qHSC中miR-378家族的qRT-PCR。(c（c）)从玉米油（qHSC）或CCl分离的原代HSC中miR-378家族的qRT-PCR4-（aHSC）治疗小鼠。(d日)通过qRT-PCR评估正常C57BL/6小鼠原代肝细胞、原代qHSC和LSEC中miR-378家族的表达。所有相对表达值的结果均显示为三次实验的平均值±标准偏差（未配对的两个样本学生t吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005).
图3
图3。MiR-378直接与Gli3结合。
(一)使用miRNA数据库(网址：www.miRNA.org)，推测miR-378a-3p的结合位点（红色字体）在gli2型和gli3基因mRNA在小鼠和人中的表达。虚线表示miR-378a-3p和gli2型或gli3基因mRNA，而灰色阴影表示miR-378a-3p的种子序列。(b条)psiCHECK-2载体包含miR-378a-3p的野生型（wt）或突变型（mut）结合位点gli2型和gli3基因构建mRNA以进行荧光素酶报告分析。突变核苷酸如补充图6所示。(c（c）)进行双重荧光素酶报告分析以验证miR-378a-3p与gli2型或gli3基因mRNA。N2a是一种小鼠神经母细胞瘤细胞系，与psiCHECK-2载体共转染，该载体包含wt或mut靶位点以及miR-378a-3p模拟物或打乱（Scr）-miR（对照）寡核苷酸。相对荧光素酶活性的结果显示为从三次重复实验（未配对的两个样本学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.005与Scr-miR）。
图4
图4。MiR-378a-3p通过减少Gli3和Gli2的表达诱导原代HSC失活。
(一)用miR-378a-3p模拟物（白色条）或打乱（Scr）-miR（对照）（黑色条）寡核苷酸转染原代aHSC 24和48小时，并表达gli3基因和英语2通过qRT-PCR进行评估。(b条)Western blot分析和(c（c）)用Laminβ1（68 kDa）作为核分数的内部控制，对核Gli3（145 kDa。所示数据代表了三个具有类似结果的实验之一。(d日)qRT-PCR分析与HSC激活相关的基因，包括波形蛋白,α-平滑肌肌动蛋白,col1α1和基质金属蛋白酶9和HSC的失活标记，绿色食品添加剂，在转染miR-378a-3p模拟物（白条）或打乱（Scr）-miR（对照）（黑条）寡核苷酸24和48小时的原代HSC中，所有相对表达值的结果显示为从三次重复实验（未配对的两个样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005与Scr-miR）。
图5
图5。Smo影响miR-378的表达。
(一)qRT–Hh信号表达的PCR，包括斯莫,gli2型,gli3基因,gli1型和ptc公司和纤维化前基因，包括转化生长因子β,α-平滑肌肌动蛋白和col1α在用（白色条）或不用（黑色条）1μM的平滑（Smo）拮抗剂GDC-0449处理LX2细胞12、24和48小时(b条)qRT-PCR分析用（白色条）或不使用（黑色条）GDC-0449处理12、24和48小时的LX2细胞中miR-378a前体（pri-miR-378b）、miR-378前体（pre-miR-388b）和miR-378m前体（pri-miR-378d）(c（c）)qRT-PCR分析用（白条）或不用（黑条）GDC-0449处理12、24和48小时的LX2细胞中成熟家族成员，包括miR-378a-3p、miR-378 b和miR-378m。所有相对表达值的结果显示为从三次重复实验（未配对的两个样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005（相对于车辆）。
图6
图6。miR-378a的表达受p65的Smo依赖性激活调节。
(一)描述了miR-378a DNA上的p65结合位点（p65BS，灰框）（箭头线）和插入pGL3-basic载体的区域（粗体线）。显示了TRANSFAC预测的一致性和假定的结合序列；下划线表示不匹配的核苷酸（nt）。构建了在pri-miR-378a启动子区具有p65结合位点（+p65BS）或不具有p65BS的pGL3-基本载体。将+p65BS和CDH-p65（黑色）或CDH-GFP（白色）联合转染HepG2细胞，将Δp65BS与CDH-p65BS（黑色）和CDH-GFP（白色）共同转染单独的一组Hep G2细胞。相对荧光素酶活性的结果显示为从三次重复实验（未配对的两个样本学生的t吨-测试*P（P）与CDH-GFP相比<0.05）。Luc，荧光素酶。(b条)的表达式级别第65页100 ng ml处理HepG2的mRNA、pri-miR-378a和miR-378a-3p−1用qRT-PCR分析TNF-α（黑色）或载体（白色）。与用载体治疗的HepG2（未配对的两个样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005（相对于车辆）。(c（c）)qRT-PCR分析经2μM Bay 11-7085（黑色）或载体（白色）处理的LX2或HepG2细胞中的pri-miR-378a和miR-378a-3p。结果显示为从三次重复实验（未配对的两个样本学生的t吨-测试**P（P）<0.005（相对于车辆）。(d日)用GDC-0449（1μM）或载体处理24和48小时的LX2细胞中SMO（86 kDa）、p65（65 kDa。(e（电子）)SMO和p65 western印迹结果的累积密度分析显示为平均值±s.e.m.（未配对双样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005（相对于车辆）。(（f）)Western blot检测载体或TNF和/或GDC-0449处理的LX2和HepG2细胞中的p65、Laminβ1（68 kDa）和GAPDH。拉明β1和GAPDH分别用作核（nuc）和细胞溶质（cyt）组分的内部对照。所示数据代表了三个具有类似结果的实验之一。(克)SMO和p65 western印迹结果的累积密度分析显示为平均值±s.e.m.（带Tukey校正的单向方差分析（ANOVA）*P（P）<0.05和**P（P）<0.005（与车辆处理的控制相比）。
图7
图7。含有miR-378a-3p的NP增加CCl中miR-378-3p的水平，但降低Gli3的表达4-治疗小鼠。
(一)qRT–聚合酶链式反应miR-378a-3p来自NP/NC、CCl的肝脏4、CCl4-用NP/NC（CCl）处理4+NP/NC）或NP/M（CCl4+NP/M）小鼠(n个=每组4人）。平均值±s.e.m.结果用图表表示（Kruskal–Wallis检验和未配对的两个样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005与NP/NC）。(b条)qRT–PCRmiR-378a-3p在静止期（d0；分离后立即）从正常小鼠分离的初级qHSC、初级aHSC（d7；培养7天）和从CCl分离的初级HSC中4+NPs治疗后3周的NP/M小鼠。相对表达值的结果显示为一式三份实验的平均值±s.e.m.（具有Tukey校正的单因素方差分析（ANOVA）*P（P）<0.05和**P（P）<0.005与d0）。(c（c）)qRT–PCR分析gli3基因NPs治疗3周后所有小鼠的肝脏中(n个=每组4人）。平均值±s.e.m.结果用图表表示（Kruskal–Wallis检验和未配对的两个样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005与NP/NC）。(d日)Western blot分析各组三只代表性小鼠肝脏中的Gli3（145 kDa）和Laminβ1（68 kDa，核分数内部对照）。所示数据代表了三个具有类似结果的实验之一。(e（电子）)Gli3-western印迹结果的累积密度分析显示为平均值±s.e.m.（Kruskal–Wallis检验和未配对双样本Student’st吨-测试**P（P）<0.05).
图8
图8。MiR-378a-3p促进CCl中HSC的失活4-治疗小鼠。
(一)qRT–PCR分析α-平滑肌肌动蛋白,波形蛋白,col1α1和金属蛋白酶组织抑制因子1NP/NC、CCl4、CCl4+NP/NC和CCl4+NPs/M组(n个=每组4人）。所有相对表达值的结果均显示为平均值±s.e.m.（Kruskal–Wallis检验和未配对双样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005与NP/NC）。(b条)Western blot分析各组代表性小鼠肝脏中的α-SMA（42 kDa）、GFAP（50 kDa。所示数据代表了三个具有类似结果的实验之一。(c（c）)α-SMA和GFAP western blotting结果的累积密度分析显示为平均值±s.e.m.（Kruskal–Wallis检验和未配对双样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005). (d日)代表性NP/NC、CCl肝切片中α-SMA的免疫组织化学研究4、CCl4+NP/NC和CCl4+NPs/M组（比例尺，100μM）。
图9
图9。miR-378在MCDE-fed小鼠和肝癌患者受损肝脏中的表达下降。
(一)qRT–原纤维化标记的PCR，波形蛋白,转化生长因子β,α-平滑肌肌动蛋白和col1α1在喂食正常饮食（CON）或补充0.1%乙硫氨酸（MCDE）的蛋氨酸/胆碱缺乏饮食的小鼠中，为期3周和4周(n个=每组4人）。绘制平均值±标准误差结果（未配对的两个样本学生的t吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005与CON）。(b条)检测了miR-378家族成员，包括miR-378a-3p、miR-379b和miR-377d在MCDE处理的小鼠中的表达(n个=每组4人）。绘制平均值±标准误差结果（未配对的两个样本学生的t吨-测试*P（P）<0.05与CON）。(c（c）)miR-378a-3p和英语3在人类肝细胞癌（HCC）患者肝组织的成对非肿瘤（NT）和肿瘤（T）区域(n个=18名患者）。由相对表达式表示的单个值用圆点表示，其平均值±标准偏差为每组的结果（成对的两个样本Student’st吨-测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.005（相对于NT）。(d日)miR-378a-3p表达与Spearman秩相关分析gli3基因肝癌NT和T的表达（Spearman秩相关分析；第页，相关系数）。
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