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.2016年3月14日；212(6):621-31.
doi:10.1083/jcb.201508102。 Epub 2016年3月7日。

脂滴介导的内质网稳态调节饥饿期间的自噬和细胞存活

阿里亚德纳·佩拉兹奎斯 1, Takashi Tatsuta公司 2, 鲁本·吉勒伯特 1, 英格马尔·德雷舍尔 1, 马丁·格雷夫 三
附属公司

脂滴介导的内质网稳态调节饥饿期间的自噬和细胞存活

阿里亚德纳·佩拉兹奎斯等。 J细胞生物学. .

摘要

脂滴是细胞内中性脂质储存的保守细胞器。最近的研究表明，LDs作为自噬的直接脂质来源发挥作用，自噬是体内平衡和应激反应中的一个中心分解代谢过程。在这里，我们证明了LD作为自噬的膜源是不必要的，但在与自噬调节相关的内质网（ER）稳态中发挥关键作用。在缺乏LDs的情况下，酵母细胞的磷脂组成发生改变，不能缓冲新生脂肪酸（FA）的合成，从而导致内质网的慢性应激和形态学改变。这些缺陷损害了自噬的调节，包括形成多个异常的Atg8点和严重受损的自噬体生物发生，导致营养应激生存的严重缺陷。重要的是，经过代谢校正的磷脂组成和LD缺乏细胞对FA抗性的改善可以治愈自噬和细胞存活。总之，我们的发现为研究LD介导的脂质稳态与自噬调节之间的复杂相互关系提供了新的视角，自噬调控可能与神经退行性疾病和代谢性疾病相关。

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图1。
图1。
LD缺乏会有条件地损害自噬。（A） wt自噬通量，Δ第7天、ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8饥饿或雷帕霉素治疗期间。数据为平均值±SD(n个= 4). （B） 按A中的方法处理细胞，并在1小时后通过荧光显微镜成像。每个细胞的Atg8点（左图）和AP（右图）的平均数量显示为平均值±SD（≥150个细胞；n个= 3). （C） wt和ΔLD细胞共存2个GFP-自动液位计8并进行了基因组标记第13节-m樱桃色在成像前将其置于饥饿状态1小时。箭头表示与ERES相关的Atg8点（Sec13-mCherry）。数据为平均值±标准差（≥150个细胞；n个= 3). 虚线表示单元格边界。（D） 饥饿期间指示菌株的存活率。棒材，1µm。t吨在A和B中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图2。
图2。
抑制从头合成FA可改善饥饿期间LD缺乏细胞的自噬、内质网形态和细胞存活率。（A） BODIPY493/503染色LD的数量（wt），Δ第7天对数期的ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞，以及6小时后的饥饿±葡萄糖（Glu）（每株150个细胞），通过荧光显微镜进行分析，如图S1 C.（B）重量，Δ第7天、ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞表达4个UPRE-GFP通过全细胞提取和使用α-GFP和α-Pgk1抗体的Western blot分析生长至对数期。GFP信号归一化为Pgk1，并在对数期（设为1）表达与wt细胞的相对（rel.）。数据为平均值±SD(n个= 4). （C） 表达GFP-HDEL（ER靶向GFP）的wt和ΔLD细胞在对数期或饥饿1h±蓝蛋白（10µg/ml）后成像。图像显示了同一Z堆栈的单个皮层和中间部分。饥饿期间ΔLD细胞的扩张小管内质网塌陷（箭头所示）的细胞数量为平均值±SD（≥150个细胞；n个= 3). 棒材，5µm。（D） 表达wt和ΔLD细胞的自噬通量2个GFP-ATG8饥饿时±蓝蛋白（10µg/ml）。数据为平均值±SD(n个= 5). （E） 按照D所述处理细胞，并按照图1 B所述通过荧光显微镜成像和分析。数据为平均值±SD（≥150个细胞；n个= 3). 虚线表示单元格边界。棒，1µm。（F） 与D中一样处理的指示菌株在饥饿期间的存活率。t吨在B、D和E中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图3。
图3。
在缺乏LD的细胞中恢复改变的PL成分可以提高自噬和饥饿时的细胞存活率。（A） 重量、ΔLD、Δ第7天, Δ阿片1和Δopi1（opi1）将ΔLD细胞培养至对数期±肌醇（2 mg/l），并按照材料和方法中的描述通过质谱分析PLs。PC、PE、PI、PS、PA和PG的相对（相对）分布显示为平均值±SD(n个≥ 3). （B） 表达wt和ΔLD细胞的自噬通量2个GFP-ATG8饥饿期间（饥饿），存在指示的肌醇浓度。数据为平均值±SD(n个= 3). （C） wt和ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8生长到对数期，并转移到饥饿±肌醇（2mg/l）。如图1 B所示，对细胞进行成像和分析。虚线表示细胞边界。棒材，1µm。（D） 饥饿期间按C处理的指示菌株的存活率。（E） wt、ΔLD或Δ的增长第7天在含有指定浓度±肌醇（2 mg/l）油酸（O）或棕榈酸（P）的平板上的菌株。t吨在A、B和C中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图4。
图4。
删除OPI1号机组在饥饿期间缓冲FA并改善LD缺乏细胞的内质网应激和形态。（A） 荧光显微镜分析Opi1-3xGFP在对数期±肌醇（2 mg/l）wt和ΔLD细胞中的定位。显示了在+肌醇培养基中生长期间代表性细胞的单个焦平面。核ER（nER）或弥漫核Opi1定位的细胞数量（≥100个细胞；n个= 3). （B） 在含有指定浓度±肌醇（2 mg/l）的油酸盐（O）或棕榈酸盐（P）的平板上生长指定菌株。（C） 重量，Δ红外线1，ΔLD，Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞表达4个UPRE-GFP在日志阶段。如图2所示对细胞进行分析。B.（D）wt，ΔLD，Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）表达GFP-HDEL（ER-GFP）的ΔLD细胞生长到对数期，饥饿±肌醇（2 mg/l）1 h，并如图2 C所示进行分析。箭头和箭头分别标记ER延伸或扩张的小管。棒材，5µm。t吨在A和C中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；ns，不显著。
图5。
图5。
增加FA抗性和恢复PL成分可治愈LD缺乏细胞中AP的生物生成和自噬通量。（A和B）自噬通量（wt）、ΔLD、Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8在存在（A）或不存在（B）肌醇（2 mg/l）的饥饿（饥饿）期间。数据为平均值±SD(n个= 4). （C） 饥饿期间指示菌株的存活率±肌醇（2 mg/l）。（D） 自噬通量（wt，ΔLD，Δ）opi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞在无肌醇培养基中生长，并在天蓝蛋白（10µg/ml）存在下饥饿。数据为平均值±SD(n个= 4). （E–G）重量，ΔLD，Δopi1（opi1）和Δ阿片1ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8按照A、B和D所述进行处理，并按照图1 B所述进行成像和分析。棒材，1µm。数据为平均值±SD（150个细胞/条件，n个= 3).t吨在A、B、D、F和G中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
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