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。2016年2月16日；7(7):7925-39.
doi:10.18632/目标6879。

Dlx-2和谷氨酰胺酶上调上皮-间质转化和糖酵解开关

李素妍 1, Hyun Min Jeon先生 1, Min Kyung Ju女士 1, 尤金贞（Eui Kyong Jeong） 1, 赵熙金（Cho Hee Kim） 1, 惠京公园 2, 宋爱翰 三, 何成康 1
附属公司

Dlx-2和谷氨酰胺酶上调上皮-间质转化和糖酵解开关

李素妍等人。 肿瘤靶点。 。

摘要

大多数癌细胞依靠葡萄糖和谷氨酰胺（Gln）代谢增强来生长和生存。致癌代谢为核苷酸、脂质和氨基酸提供生物合成前体；然而，其在肿瘤进展中的具体作用尚不清楚。我们之前发现，参与胚胎和肿瘤发育的同源结构域转录因子远端少同源盒-2（Dlx-2）通过诱导Snail的表达诱导糖酵解转换和上皮-间质转化（EMT）。在这里，我们发现Dlx-2还诱导关键的谷氨酰胺代谢酶谷氨酰胺酶（GLS1）的表达，该酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸。TGF-β和Wnt以Dlx-2依赖方式诱导GLS1表达。GLS1 shRNA（shGLS1）抑制体内肿瘤转移和生长。shGLS1、Gln剥夺和Gln代谢抑制剂（DON、968和BPTES）对Gln代谢的抑制阻止了Dlx-2-、TGF-β-、Wnt-和Snail诱导的EMT和糖酵解转换。最后，shDlx-2和Gln代谢抑制通过p53依赖性上调蜗牛靶向microRNA降低蜗牛mRNA水平。这些结果表明，Dlx-2/GLS1/Gln代谢轴是TGF-β/Wnt诱导的蜗牛依赖性EMT、转移和糖酵解转换的重要调节因子。

关键词：Dlx-2；GLS1；蜗牛；上皮-间充质转化；糖酵解开关。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。TGF-β和Wnt3a通过激活Dlx-2诱导GLS1表达
A-C.公司。用Dlx-2转染MCF-7细胞。通过微阵列分析检测细胞基因转录的变化（A）。图中显示了与Mock相比，表达中的折叠增加。使用指定的引物和抗体，通过实时qrtPCR（B）和免疫印迹（C）分析细胞**第页<0.01与模拟。D。用实时qrtPCR检测转染Dlx-2和shSnail的MCF-7细胞GLS1的表达**第页<0.01与模拟。E.公司。人体示意图GLS1级启动子区域如左图所示，预测的4个Dlx-2结合位点用黑框表示，编号为D1、D2、D3和D4。使用引物#1、#2或#3扩增富含ChIP的DNA，所述引物分别包含GLS1启动子中的D1/D2、D3或D4结合位点。用Dlx-2转染MCF-7细胞，并使用ChIP分析进行分析（右侧面板）。F、 G.公司。通过实时定量PCR（F）和免疫印迹（G）检测转染shDlx-2或shSnail后再经TGF-β处理的MCF-7细胞GLS1的表达**第页<0.01与未治疗相比，##第页与shCon相比<0.01。H。用TGF-β处理MCF-7细胞并用ChIP分析。一、 J。用Smad 2/3/4的shRNA转染MCF-7细胞，然后用TGF-β处理。然后通过实时qrtPCR（I）和免疫印迹（J）分析细胞GLS1的表达**第页<0.01与未治疗相比，##第页与shCon相比<0.01。K、 L。用实时定量PCR（K）和免疫印迹（L）分析shDlx-2或shSnail转染MCF-7细胞并经Wnt3a-CM处理后GLS1的表达**第页与未治疗组相比<0.01，##第页与shCon相比<0.01。M。使用Wnt3a CM处理MCF-7细胞，并使用ChIP分析进行分析。N、 O。用β-连环蛋白、TCF4和Axin1/2的shRNA转染MCF-7细胞，然后用Wnt3a CM处理。然后通过实时qrtPCR（N）和免疫印迹（O）分析细胞的GLS1表达**第页<0.01与未治疗相比，##第页与shCon相比<0.01。所有误差条代表SE。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。
图2
图2。shGLS1抑制肿瘤生长和转移
资产负债表。将稳定转染shCon或shGLS1的HCT116细胞皮下注射到裸鼠背部(n个= 4-5). 显示了代表性小鼠的肿瘤生长曲线（A）和照片、肿瘤（B）、肿瘤重量（C）和H&E染色（D）*第页< 0.05; **第页与shCon相比<0.01。E-G.公司。1×106将稳定转染shCon或shGLS1的HCT116细胞注入裸鼠尾静脉(n个= 3-5). 代表性肺部的照片（E）和肺切片的H&E染色如图（F）所示。转移结节数（G）**第页与shCon相比<0.01。所有误差条表示SE。所有刻度条表示100μm。
图3
图3。抑制谷氨酰胺代谢可预防EMT
A-C.公司。用Dlx-2和shGLS1联合转染MCF-7细胞。用相控显微镜（A）分析细胞形态。使用指定的引物和抗体，通过实时qrtPCR（B）和免疫印迹（C）分析细胞**第页<0.01与模拟，##第页与shCon相比<0.01。D-I型。用shGLS1转染MCF-7细胞，然后用TGF-β（D-F）或Wnt3a-CM（G-I）处理。通过相控显微镜分析细胞形态（D，G），并使用指示的引物和抗体通过实时qrtPCR（E，H）和免疫印迹（F，I）分析细胞**第页与未治疗组相比<0.01，#第页< 0.05;##第页与shCon相比<0.01。J-L.公司。用Snail和2种不同的shGLS1构建体（#1和#2）共转染MCF-7细胞。用相差显微镜（J）分析细胞形态。使用指定的引物和抗体，通过实时qrtPCR（K）和免疫印迹（L）对细胞进行分析**第页<0.01与模拟，#第页< 0.05;##第页与shCon相比<0.01。M、 N。用shDlx-2转染MCF-7细胞，然后在有无α-KG的情况下用TGF-β处理，并用相控显微镜（M）分析细胞形态。细胞还通过实时qrtPCR分析E-cadherin、GLS1和蜗牛表达（N）**第页<0.01与未治疗相比，##第页与shCon相比<0.01，§第页< 0.05;§§第页在没有α-KG的情况下，与shDlx-2相比<0.01。所有误差条代表SE。所有比例尺代表100μm。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。
图4
图4。shDlx-2或Gln代谢抑制增加p53的表达
A、 B。用实时定量PCR（A）和免疫印迹（B）检测shDlx-2或shGLS1转染的MCF-7细胞经α-KG处理后p53的表达**第页与shCon相比<0.01，##第页与未经治疗相比，<0.01。C、 D。通过实时qrtPCR（C）和免疫印迹（D）分析用DON处理或在无Gln培养基中培养的MCF-7细胞的p53表达**第页与对照组相比<0.01。E、 F、。通过实时定量PCR（E）和免疫印迹（F）检测转染shDlx-2或shSnail后再经TGF-β处理的MCF-7细胞p53的表达**第页与shCon相比<0.01，##第页与未经治疗相比，<0.01。G.公司。用相控显微镜分析shDlx-2或shGLS1和shp53共转染MCF-7细胞，然后用TGF-β处理后的细胞形态（左）和圆形度（右）。显示沿单元格边缘绘制的边界（白色），以量化圆形。结果（每组54-158个细胞）显示为平均值±SE**第页<0.01与未治疗相比，##第页<0.01，与含有TGF-β的shCon相比，§§第页与shDlx-2或带有TGF-β的shGLS1相比，<0.01。H。转染shp53基因的MCF-7细胞，然后在含有TGF-β的完全或无Gln-培养基中培养，用相控显微镜分析细胞形态（左）和圆形（右）。显示沿单元格边缘绘制的边界（白色），以量化圆形。结果（每组26-134个细胞）以平均值±SE表示**第页<0.01与未治疗相比，##第页与含有TGF-β的完整培养基相比，<0.01，§§第页在含有TGF-β的无Gln-培养基中，与shCon相比<0.01。所有误差条表示SE。所有刻度条表示100μm。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。
图5
图5。Gln代谢与TGF-β-、Wnt3a-和Dlx-2/蜗牛诱导的糖酵解转换和线粒体抑制有关
答：。用Dlx-2和shGLS1联合转染MCF-7细胞。对细胞进行Glc消耗、Lac生成、线粒体呼吸和ATP来源分析**第页<0.01与模拟，##第页与shCon相比<0.01。B、 C、。用shGLS1转染MCF-7细胞，然后用TGF-β（B）或Wnt3a-CM（C）处理。对细胞进行Glc消耗、Lac生成、线粒体呼吸和ATP来源分析**第页<0.01与未治疗相比，##第页与shCon相比<0.01。D。将蜗牛和shGLS1联合转染MCF-7细胞。分析细胞的Glc消耗、Lac生成、线粒体呼吸和ATP来源**第页<0.01与模拟，##第页与shCon相比<0.01。有氧呼吸（黑条）和糖酵解（灰条）产生的ATP量通过测量细胞中的耗氧量和Lac生成量来计算（A-D中的右侧面板）。所有误差线代表SE。
图6
图6。Dlx-2、GLS1、p53、Snail和Snail靶向miRNA在人类肿瘤中的表达
A-C.公司。实时qrtPCR数据显示Dlx-2、GLS1、p53和蜗牛mRNA的表达，以及乳腺癌（A）、结肠癌（B）和卵巢癌（C）所示肿瘤类型和组织学分期（TNM分类）的正常（N）和肿瘤（T）组织中Dlx-2、蜗牛和GLS1蛋白的免疫印迹。D。Ponceau S染色膜显示装载了相同数量的蛋白质。E.公司。所示肿瘤类型中正常（N）和肿瘤（T）组织中蜗牛靶向miRNA的实时qrtPCR数据。将miRNAs的相对水平归一化为相应的正常组织*第页< 0.05; **第页与匹配的正常（N）组织相比，<0.01。所有误差线代表SE。F、。示意图显示了Dlx-2/GLS1驱动的Gln代谢的一种新功能，该功能有助于蜗牛依赖性EMT和糖酵解转换。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。
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