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.2016年1月1日；351(6268):43-8.
doi:10.1126/science.aab2674。 Epub 2015年10月8日。

Sestrin2是mTORC1途径的亮氨酸传感器

瑞秋·L·沃尔夫森 1, Lynne Chantranupong 1, 罗伯特·萨克斯顿 1, 匡申 1, 索尼娅·M·斯卡里亚 2, 杰森·坎托 1, 大卫·M·萨巴蒂尼 三
附属公司

Sestrin2是mTORC1途径的亮氨酸传感器

瑞秋·L·沃尔夫森等人。 科学类. .

摘要

亮氨酸是一种蛋白原氨基酸，它还调节哺乳动物生理的许多方面，主要是通过激活主生长控制器mTOR复合物1（mTORC1）蛋白激酶。氨基酸通过Rag鸟苷三磷酸酶（GTP酶）向mTORC1发出信号。几个因子调节Rags，包括GATOR1，aGTPase激活蛋白；GATOR2，一个未知函数的正调节器；和Sestrin2，一种抑制mTORC1信号传导的GATOR2相互作用蛋白。我们发现，亮氨酸（而非精氨酸）以20微摩尔的解离常数与Sestrin2结合，从而中断了Sestrin2-GATOR2的相互作用，这是亮氨酸浓度半最大限度地激活mTORC1。Sestrin2的亮氨酸结合能力是亮氨酸激活细胞内mTORC1所必需的。这些结果表明Sestrin2是mTORC1通路的亮氨酸传感器。

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数字

图1
图1。亮氨酸（而非精氨酸）干扰细胞中的Sestrin2-GATOR2相互作用在体外
A） 稳定表达FLAG-WDR24（GATOR2的一种成分）的HEK-293T细胞中Sestrin2与GATOR2结合。细胞被剥夺亮氨酸、精氨酸或所有氨基酸50分钟。如有指示，用亮氨酸、精氨酸或所有氨基酸再刺激细胞10分钟，并用细胞裂解物制备FLAG免疫沉淀物。免疫沉淀物和裂解物通过免疫印迹法分析所指示的蛋白质。FLAG-meta2作为阴性对照。B） 亮氨酸和精氨酸对氨基酸保护细胞的冰镇洗涤剂裂解液中Sestrin2-GATOR2相互作用的影响。稳定表达FLAG-meta2或FLAG-WDR24的HEK-293T细胞被剥夺所有氨基酸50分钟。将亮氨酸或精氨酸添加到培养基或细胞裂解物中，并按（A）所述制备和分析FLAG免疫沉淀物。C） 单个氨基酸对纯化的Sestrin2-GATOR2复合物的影响。从稳定表达FLAG-meta2或FLAG-WDR24的HEK-293T细胞中制备FLAG免疫沉淀，并去除所有氨基酸50分钟。将指示的氨基酸（300µM）直接添加到免疫沉淀物中，重新清洗后，对其进行分析，如（A）所示。D） 亮氨酸破坏纯化的Sestrin2-GATOR2复合物。除使用了指示浓度的亮氨酸或精氨酸外，实验按（C）进行和分析。E） 异亮氨酸和蛋氨酸对Sestrin2-GATOR2相互作用的干扰。除使用了指示浓度的异亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸或精氨酸外，实验按（C）进行和分析。
图2
图2。Sestrin2将亮氨酸与Kd日20µM
A） 放射性标记的亮氨酸与Sestrin2结合，但不与WDR24、GATOR2或控制蛋白Rap2A结合。从瞬时表达指示蛋白或复合物的HEK-293T细胞制备的FLAG免疫沉淀物用于与[三H] 方法中描述的亮氨酸。在指定位置添加未标记的亮氨酸。值为一个代表性实验的3个技术重复的平均值±SD。SDS-PAGE和Coomasie蓝染色用于分析与结合分析中包含的免疫沉淀平行制备的免疫沉淀。星号表示WDR24和GATOR2纯化中的分解产物。B） Sestrin1（两种异构体）、Sestrin2和Sestrin3的亮氨酸结合能力。制备FLAG免疫沉淀物，并进行结合分析，如（A）所示。C） 亮氨酸与细菌产生的Sestrin2结合，但不与RagA/RagC异二聚体结合。按照方法中所述进行亮氨酸结合分析，并使用与Ni-NTA树脂结合的His-MBP-Sestrin2或His-RagA/RagC进行分析（A）。D） 在热位移分析中亮氨酸和精氨酸对细菌产生的Sestrin2熔化温度的影响。His-MBP-雌激素与含有或不含亮氨酸或精氨酸的Sypro橙色染料孵育。加热样品后，捕获荧光变化，并用于计算所示条件下的熔化温度（Tm）。数值为3个重复的平均值±标准偏差。E） Sestrin2将亮氨酸与Kd日20µM。按照（A）制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM或20µM的结合分析[三H] 亮氨酸和未标记亮氨酸的指示浓度。在所示的代表性图表中，每个点代表10µM测定中n=3的归一化平均值±SD[三H] 亮氨酸。这个Kd日根据六个实验的结果计算得出（三个10µM，三个20µM[三H] 亮氨酸）。F） 蛋氨酸可以竞争亮氨酸与Sestrin2的结合。如（A）所述制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM[三H] 亮氨酸和未标记蛋氨酸的指示浓度。在所示图表中，每个点代表n=3的标准化平均值±SD。这个K我使用三个实验的数据进行计算。G） 异亮氨酸可以竞争亮氨酸与Sestrin2的结合。如（A）所述制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM[三H] 亮氨酸和未标记异亮氨酸的指示浓度。在所示图表中，每个点代表n=3的标准化平均值±SD。这个K我使用三个实验的数据进行计算。
图3
图3。Sestrin2通过GATOR2调节mTORC1
A） 通过S6K1磷酸化测定不同亮氨酸浓度对mTORC1活性的影响。HEK-293T细胞被剥夺亮氨酸50分钟，并用指示浓度的亮氨酸重新刺激10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物中的指示蛋白质和磷酸化状态。B） 不同亮氨酸浓度对Sestrin2-GATOR2相互作用的影响。如（A）所示，稳定表达所示蛋白的HEK-293T细胞被饥饿，并收集FLAG免疫沉淀物。用指示浓度的亮氨酸处理免疫纯化复合物，然后如图1C所示进行分析。C） Sestrin2 S190W突变体的GATOR2结合能力降低。从瞬时表达所指示的蛋白质的HEK-293T细胞制备FLAG免疫沉淀物，并通过免疫印迹分析所指示的蛋白质。D） Sestrin2 S190W亮氨酸结合能力的测定。如图2A所示，进行分析并分析免疫沉淀物。E） 在表达Sestrin2 S190W的Sestrin1-3三重零细胞中，mTORC1通路无法检测到亮氨酸的缺失。使用CRISPR/Cas9系统生成的野生型HEK-293T细胞和Sestrin1-3三重零HEK-293 T细胞表达所示的FLAG标记蛋白。细胞缺亮氨酸50分钟，如有指示，用亮氨酸刺激10分钟，并通过免疫印迹分析裂解产物。
图4
图4。Sestrin2结合亮氨酸的能力是mTORC1途径感知亮氨酸所必需的
A） Sestrin2 L261A和E451A突变体不结合亮氨酸。如图2A所示，进行结合分析和免疫沉淀物分析。B） Sestrin2 L261A或E451A与GATOR2相互作用的亮氨酸敏感性。从瞬时表达所示蛋白的细胞中制备FLAG免疫沉淀。用指定浓度的亮氨酸处理免疫沉淀物，并如图1C所示进行分析。C） 在表达Sestrin2 L261A或E451A的Sestrin1-3三重空细胞中，mTORC1通路不能检测到亮氨酸的存在。细胞的生成和分析如图3E所示。D） 该模型显示了不同隔室中多个传感器产生的氨基酸输入如何影响Rag GTPases以控制mTORC1活性。
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中的注释

  • 细胞信号：mTORC1如何感应亮氨酸。
    鲍曼K。 鲍曼K。 Nat Rev Mol细胞生物学。2015年12月；16(12):699. doi:10.1038/nrm4088。Epub 2015年11月4日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2015 PMID：26530388 没有可用的摘要。
  • 细胞信号。看到mTORC1特异性。
    Buel GR，Blenis J。 Buel GR等人。 科学。2016年1月1日；351(6268):25-6. doi:10.1126/science.aad9696。 科学。2016 PMID：26721988 没有可用的摘要。

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