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.2015年10月1日；125(10):3831-46.
doi:10.1172/JCI79264。 Epub 2015年9月21日。

胰岛素需求通过未折叠蛋白反应调节β细胞数量

罗希特·夏尔马, 艾米·奥唐纳, 瑞秋·E·斯塔马特里斯, 平河, 凯伦·麦克洛斯基, 保罗·R·雷诺兹, 彼得·阿尔文, 劳拉·阿隆索

胰岛素需求通过未折叠蛋白反应调节β细胞数量

罗希特·夏尔马等。 临床研究杂志. .

摘要

尽管干细胞群体介导快速周转组织（如皮肤、血液和肠道）的再生，但尚未确定一些周转较慢组织（如胰岛）的干细胞库。尽管缺乏可识别的干细胞，但小鼠胰腺β细胞数量随着胰岛素需求的增加而增加。血统追踪显示，新的β细胞是由成熟、分化的β细胞增殖产生的；然而，这些成熟细胞感知全身胰岛素需求并启动增殖反应的机制尚不清楚。在这里，我们确定了β细胞未折叠蛋白反应（UPR），它感测胰岛素的产生，作为β细胞增殖的调节器。利用遗传和生理模型，我们确定在β细胞群中，那些具有活跃UPR的细胞更有可能增殖。此外，阈下内质网应激（ER应激）通过激活ATF6驱动胰岛素需求诱导的β细胞增殖。我们还证实，UPR调节人类β细胞的增殖，表明治疗性UPR调节有可能扩大糖尿病风险人群的β细胞质量。总之，这项工作定义了一个干细胞依赖的组织稳态模型，其中分化分泌细胞使用UPR传感器来调整器官大小以满足需求。

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数字

图10
图10。模型：一种分泌细胞类型β细胞如何通过增殖将蛋白质合成需求与细胞数量增加联系起来。
(A类)β细胞应力连续体。先前已知过多内质网负荷会导致β细胞功能障碍和死亡。目前的研究增加了一个新概念，即适度内质网负荷（已知可促进内质网容量的功能适应）也会通过增殖导致β细胞数量的组织适应。这一连续体说明了一个潜在的应激治疗窗口，可能以促进β细胞质量膨胀为目标。(B类)UPR如何激活β细胞增殖的示意图。
图9
图9。UPR是通过ATF6增加人类β细胞增殖所必需的，也是足够的。
(A类)将人胰岛分散在玻璃盖玻片上培养96小时，并在整个培养过程中向培养基中添加BrdU。箭头表示BrdU-阳性β细胞。比内分泌细胞核大的成纤维细胞核标记为F(B类)高糖状态下人β细胞增殖增加(n个= 12). 由于捐赠者之间的基线增殖差异很大，随后的小组显示数据标准化为7.5 mM的增殖率。补充图13中给出了每个准备的原始非标准化数据。(C类和D类)低剂量Tg（20 mM，C类)或Tm（10–100 ng/ml，D类)人β细胞增殖增强(n个= 6–12). (E类)TUDCA和PBA降低15 mM葡萄糖中的人β细胞增殖(n个= 6). (F类和G公司)在15 mM葡萄糖中，ATF6抑制剂的存在降低了人β细胞的增殖(n个= 7;F类)并且随着ATF6的过度表达而增加(n个= 4;G公司). (A类)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及†P（P）通过方差分析，<0.0001(C类–E类)或学生的t吨测试(B类,F类、和G公司).
图8
图8。ATF6通路对于葡萄糖诱导的体外β细胞增殖是必要的和充分的。
(A类)在原代小鼠β细胞中，ATF6和IRE1通路的小分子抑制剂显著降低了葡萄糖诱导的增殖，而PERK抑制剂则没有显著降低(n个= 3–4). 细胞周期蛋白D2过度表达直接激活细胞周期不受影响，这与非特异性毒性相矛盾。(B类)免疫印迹显示，ATF6和IRE1抑制剂均可降低葡萄糖诱导的胰岛细胞增殖细胞核抗原(n个= 3). (C类–G公司)IRE1过度表达(n个= 3,C类和D类)，sXBP1(n个= 4,E类和G公司)，或ATF6(n个= 4,F类和G公司)在小鼠胰岛细胞中，只有ATF6增加了β细胞的增殖。(H（H）–P（P）)shRNA敲除小鼠原代胰岛细胞中的ATF6或IRE1表明，葡萄糖诱导的β细胞增殖需要ATF6和IRE1的最佳水平(n个= 3–6,我和J型)尽管只有ATF6敲除降低了PCNA丰度(n个= 3–5,K（K）–P（P）).H（H）显示击倒我;K（K）对于L（左）和米; 和N个对于J型,O（运行）、和P（P）所有实验的持续时间为72小时。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及†P（P）通过方差分析，<0.0001(A类,B类,D类,G公司,我、和J型)或学生的t吨测试(L（左）,米,O（运行）、和P（P）).
图7
图7。体内胰岛素需求诱导的β细胞增殖需要UPR激活。
(A类)安乐死前2天每天两次静脉注射TUDCA可降低秋田和分贝/分贝-BLKS ER负荷模型。图像代表了n个=3个生物复制。(B类–G公司)两天每天两次腹腔注射TUDCA可降低2周龄秋田小鼠的β细胞增殖(B类和C类;n个=3–5），4周龄分贝/分贝老鼠(D类和E类;n个=5–13），在喂食HFD的小鼠中(F类和G公司;n个= 5–8). 图像是在放大倍数为200倍的条件下采集的。箭头指向BrdU-阳性β细胞。数据表示为平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）方差分析显示<0.01。
图6
图6。葡萄糖诱导的β细胞体外增殖需要UPR激活。
(A类)化学伴侣TUDCA和PBA通过15 mM葡萄糖降低小鼠胰岛细胞UPR激活。(B类和C类)伴侣TUDCA和PBA可降低PCNA的葡萄糖诱导。免疫印迹A类和B类代表n个=3-4个独立实验。(D类和E类)用TUDCA或PBA缓解内质网应激可阻止葡萄糖诱导的小鼠β细胞增殖(n个= 4). (F类和G公司)TUDCA和PBA均未减少过度表达cyclin D2诱导的增殖，这是对BrdU摄取或增殖的非特异性毒性作用的反驳(n个= 3). 数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）方差分析结果<0.001。
图5
图5。体内内质网应激在失代偿前增加β细胞增殖。
(A类–E类)分贝/分贝/当存在UPR但胰岛失代偿前，BLKS小鼠的β细胞增殖增加。(A类和B类)年体重和血糖接近正常分贝/分贝小鼠在4周龄时出现，但在11-14周龄时出现肥胖和糖尿病（成年；n个= 3–5). (C类–E类)4周大时，UPR已经活跃(D类)β细胞增殖增加(n个= 4–6;C类和E类). 成人分贝/分贝小鼠β细胞失代偿明显（高血糖、胰岛形态丧失；n个= 6–10). (F类–K（K）)内质网应激直接作用于β细胞足以增加体内β细胞的增殖。(F类–H（H）)杂合秋田小鼠在2周龄和3周龄时血糖和体重正常，但在4周龄时出现高血糖(n个= 4–22). 胰腺切片显示2周大时UPR已经激活。(我–K（K）)在2周龄和3周龄时，即UPR活跃但失代偿开始前，BrdU掺入升高(n个= 3–5). (K（K）)使用PCNA染色确认2–3周龄的秋田β细胞增殖(n个= 5–11). (D类,E类,H（H）、和我)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（学生）t吨测试。
图4
图4。体外激活轻度UPR可增加β细胞增殖和β细胞数量。
(A类和B类)在原代小鼠胰岛细胞中，低剂量Tg（2–20 nM）或Tm（10–100 ng/ml）可进一步增加由15 mM葡萄糖诱导的PCNA。明显存在明显的药物剂量阈值；在较高剂量的Tg或Tm下，PCNA突然丢失，失代偿标记物CHOP(A类)和激活的caspase 3(B类)被诱导。波段以下的数字是平均波段强度量化n个=5-7个免疫印迹；平均值图见补充图4*P（P）<0.05 vs.15 mM车辆。(C类–E类)低剂量Tg或Tm处理的小鼠胰岛细胞在高糖下增加增殖(n个= 3). (F类和G公司)磷酸化氢istone H3证实细胞增殖(n个= 3). (H（H）)秋田胰岛素原的表达促进β细胞增殖(n个= 5). (我–L（左）)流式细胞仪定量细胞计数显示低剂量Tg和Tm处理的培养物中β细胞数量增加(n个= 5–7). (J型和K（K）)低剂量Tg不会诱导细胞死亡(n个= 4). (C类和F类)放大倍数为200倍的图像。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及†P（P）方差分析结果<0.0001。P（P）中的值A类,B类,G公司、和我–L（左）与15 mM车辆相比。
图3
图3。在胰岛素需求增加期间激活UPR的β细胞更有可能增殖。
(A类和B类)β细胞BiP在葡萄糖输注小鼠胰腺切片中的表达是异质的；高血糖增加了BiP高表达的β细胞数量。代表性图像显示自n个=3（盐水）和n个=4只（葡萄糖）小鼠。(C类)在体外，葡萄糖增加了BiP高表达的原代小鼠胰岛细胞（门控胰岛素[+]）的数量。(D类–G公司)在高血糖小鼠的胰腺切片中，PCNA染色经常出现在BiP高表达的β细胞中（箭头），而在BiP低表达的β电池中较少出现（箭头）。(H（H）和我)高血糖胰腺切片(H（H）)或高脂肪饲料(我)小鼠，含有高BiP的β细胞更有可能是PCNA阳性(n个= 3–5). (J型和K（K）)在体外，通过流式细胞术，葡萄糖增加了原代小鼠β细胞BrdU的掺入和细胞数量(n个= 3). (L（左）–N个)在葡萄糖刺激下，BiP高的小鼠β细胞更有可能是BrdU阳性(n个= 3). (O（运行）)相反，在过度表达cyclin D2的原代小鼠β细胞中，BrdU掺入并不局限于高BiP表达细胞。(A类和D类–G公司)放大倍数为200倍的图像。中的图像D类–G公司和中的流程图C类,L（左）,米、和O（运行）代表n个=3-5个实验。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）方差分析结果<0.001(H（H）,我、和N个)或学生的t吨测试(J型和K（K）).
图2
图2。体外增殖葡萄糖治疗激活胰岛细胞UPR而不失代偿。
(A类–K（K）)将小鼠胰岛分散并培养在无涂层玻璃上(A类和B类)或塑料(C类–K（K）)72小时(A类,B类,D类,G公司、和K（K）)或48小时(C类,E类,F类、和H（H）–J型). 用BrdU掺入法测定15 mM葡萄糖中β细胞增殖增加(A类和B类;n个=3）和增殖标记物Ki67和PCNA的丰度(C类;n个=3）或免疫印迹(D类). 箭头输入A类表示BrdU阳性β细胞。增殖胰岛细胞培养中UPR标记物BiP和钙网蛋白（CalR）增加(D类免疫印迹；E类、qPCR、，n个= 3). 所有3条经典UPR通路在15 mM葡萄糖中均被激活：sXbp公司(F类; RNA分析，n个=3），p-eIF2α(G公司、免疫印迹）和ATF6(G公司免疫印迹；H（H）、qPCR、，n个=3），以及ATF6和XBP转录靶点(我和J型,n个= 3). 失代偿标记物CHOP在5 mM葡萄糖中最高(K（K）). 免疫印迹D类,G公司、和K（K）是以下方面的代表性示例n个=5-9个独立重复；量化D类,F类,G公司、和K（K）如补充图2所示。香港，家政基因。中的图像A类放大倍数为200倍。(A类–K（K）)数字5、7.5和15表示葡萄糖浓度。数据表示为平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图1
图1。增殖条件下胰岛的蛋白质组学筛选显示UPR的激活而没有ER失代偿。
(A类)体内高血糖4天后对胰岛进行蛋白质组学筛选，提示分泌途径肽合成和UPR激活。(B类–E类)体内葡萄糖暴露后胰岛RNA分析证实UPR激活(商业保险,附件6，秒Xbp公司)无失代偿（CHOP；n个= 4–8). (F类)免疫印迹证实增殖（PCNA）增加，sXBP和p-eIF2α蛋白水平增加(n个= 4). 在p-eIF2印迹中可以看到PCNA带，因为PCNA是首先被探测到的，并且膜没有被剥离。免疫印迹定量如补充图1所示。(G公司–J型)输注后的胰腺透射电镜显示，高血糖小鼠β细胞中的粗面内质网正常，未分化，证实没有失代偿内质网应激（典型图像；n个=3只葡萄糖注射小鼠[Glu]和n个=评估了4个对照[Sal]）。香港，家政基因。数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01（按学生）t吨测试。Un，未插片；Sp，拼接。比例尺，500 nm。
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中的注释

  • Neuronatin和葡萄糖诱导胰腺β细胞应激。
    Asahara SI公司。 Asahara SI公司。 糖尿病研究杂志。2019年5月；10(3):574-576. doi:10.1111/jdi.12993。Epub 2019年1月23日。 糖尿病研究杂志。2019 PMID：30565863 免费PMC文章。

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