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.2015年10月16日；290(42):25497-511.
doi:10.1074/jbc。M115.681445。 Epub 2015年9月3日。

一种激活转录因子4（ATF4）依赖性途径的鉴定及其小分子抑制作用

斯科特·M·埃伯特 1, 迈克尔·C·迪勒 2, 史蒂芬·A·布拉德 三, 杰森·迪尔多夫 三, 达里尔·J·莫里 4, 丹尼尔·福克斯 2, Kale S Bongers公司 2, 维托A里拉 5, 大卫·K·迈耶霍兹 6, 约翰·J·塔利 7, 克里斯托弗·M·亚当斯 8
附属公司

一种激活转录因子4（ATF4）依赖性途径的鉴定及其小分子抑制作用

斯科特·M·埃伯特等人。 生物化学杂志. .

摘要

衰老会降低骨骼肌的质量和强度，但其潜在的分子机制仍不清楚。在这里，我们使用小鼠模型来研究与年龄相关的骨骼肌无力和萎缩的分子机制，以及针对这些情况的新的潜在干预措施。我们发现两种小分子可以显著降低骨骼肌强度、质量和质量的年龄相关性缺陷：熊果酸（一种在苹果中发现的五环三萜类化合物）和蕃茄碱（一种从绿色番茄中提取的甾体生物碱）。由于小分子抑制剂有时可以提供疾病过程的机制性见解，我们使用熊果酸和托马替丁来研究与年龄相关的肌肉无力和萎缩的发病机制。我们发现熊果酸和tomatidine在衰老骨骼肌中产生数百个mRNA水平的微小正负变化，并且这两种化合物的mRNA表达特征非常相似。有趣的是，在老化肌肉中，熊果酸和番茄红素抑制的mRNAs的一个子集通过激活转录因子4（ATF4）进行正调控。基于这一发现，我们研究了ATF4作为与年龄相关的肌肉无力和萎缩的潜在介质。我们发现，骨骼肌ATF4表达的靶向性减少可减少骨骼肌强度、质量和质量的年龄相关缺陷，类似于熊果酸和托马替丁。这些结果阐明了ATF4是年龄相关性肌肉无力和萎缩的关键介质。此外，这些结果确定熊果酸和番茄烷是降低老年骨骼肌ATF4活性、虚弱和萎缩的潜在药物和/或先导化合物。

关键词：ATF4；老化；肌肉萎缩；蛋白质合成；肌肉减少；骨骼肌；骨骼肌萎缩；骨骼肌代谢；托马提丁；熊果酸。

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数字

图1。
图1。
年龄相关性骨骼肌无力和萎缩的小鼠模型。 A–F，我们比较了成年（6个月）体重匹配的队列(瞬间。))和年龄大（22个月）的雄性C57BL/6小鼠。A类双侧股四头肌和肱三头肌的总重量。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E。B类，股四头肌横截面的代表性H&E图像。C类，股四头肌IIb型和IIx型纤维的平均直径。每个数据点代表一只老鼠的≥800个IIb型光纤或≥100个IIx型光纤的平均值，以及水平钢筋表示平均值±S.E.的平均值。天，所有IIb型光纤的尺寸分布C.E公司,体内前肢握力。每个数据点代表一只鼠标五次测量的平均值，以及水平钢筋表示平均值±S.E.的平均值。F类,体外指长伸肌产生的特定强直力。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E.InA类,C类,E类，以及F类,对值是用t吨测验。千牛，千牛顿。
图2。
图2。
乌索酸和托马替丁可减少与年龄相关的骨骼肌无力和萎缩。 A–G，提供22个月龄雄性C57BL/6小鼠的体重匹配队列随意在进行下述分析之前，使用标准食物（“对照”）或添加0.27%熊果酸或0.05%托马提丁的标准食物2个月。A类乌索酸和托马替丁的稳态血浆水平。数据为每组三只小鼠的平均值±S.E。B类双侧股四头肌和肱三头肌的总重量。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E。C类，股四头肌横截面的代表性H&E图像。天，股四头肌肌纤维的平均直径。数据是每队列四只小鼠IIb型和IIx型股四头肌纤维平均直径的平均值±S。E.*、，对< 0.05; **,对< 0.01.不适用。表示对> 0.05.E类，所有IIb型光纤的尺寸分布D.F公司,体内前肢握力。每个数据点代表一只鼠标五次测量的平均值，以及水平钢筋表示平均值±S.E.的平均值。G公司,体外指长伸肌产生的特定强直力。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E.InB类,天,F类，以及G公司,对用Dunnett的多重比较试验进行单因素方差分析。千牛，千牛顿。
图3。
图3。
在老龄小鼠中，熊果酸和托马替丁不会改变总体重或心脏、肝脏或脂肪垫的重量。 A–F，提供22个月龄雄性C57BL/6小鼠的体重匹配队列随意使用标准食物（对照）或添加0.27%熊果酸或0.05%托马替丁的标准食物2个月。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E。A类，初始总体重。B类，最终总体重。C类，心脏重量。天，肝脏重量。E类，双侧腹膜后脂肪垫的组合重量。F类，双侧附睾脂肪垫的组合重量。对用Dunnett的多重比较试验进行单因素方差分析。不适用。表示对> 0.05.
图4。
图4。
用熊果酸或托马替丁治疗2个月后，老年骨骼肌中Akt/mTORC1信号的稳态水平没有改变。数据来自22个月大的C57BL/6小鼠的股四头肌，如图2和图3所示，用对照饮食、熊果酸饮食或tomatidine饮食治疗2个月。A类用抗S6K和抗磷酸S6K抗体对股四头肌蛋白提取物进行免疫印迹分析。左侧、代表性免疫印迹和Ponceau S染色。中间，总S6K的量化。赖特，量化每个提取物中磷酸化S6K与总S6K的归一化比率。B类，股四头肌蛋白提取物用抗Akt和抗磷酸-Akt抗体进行免疫印迹分析。左侧、代表性免疫印迹和Ponceau S染色。中间，总Akt的量化。赖特，每个提取物中磷酸化Akt与总Akt的归一化比率的定量。水平条表示平均值±S.E。对这些值是通过单因素方差分析和Dunnett的多重比较试验确定的。不适用。表示对> 0.05.
图5。
图5。
老年骨骼肌中熊果酸和托马替丁的mRNA表达特征高度相似，包括ATF4依赖mRNA的抑制。 A类和B类，数据来自图2中22个月龄C57BL/6小鼠的股四头肌，这些小鼠接受了2个月的对照饮食、熊果酸饮食或tomatidine饮食。使用老鼠参考-8 2.0版珠芯片阵列分析四头肌mRNA，其中包含>25000个探针到>19000个mRNA转录本。n个=每个条件5–6个阵列。通过归一化对数确定熊果酸和托马替丁对单个探针信号的影响2分别来自熊果酸处理小鼠和tomatidine处理小鼠的log信号2来自对照小鼠的信号。统计显著性被任意定义为对双尾非配对≤0.025t吨测试。A类散点图显示了熊果酸和托马替丁对1289个mRNA探针的影响，这些探针的信号被熊果酸显著改变。重点介绍了一些感兴趣的信使核糖核酸。B类散点图显示了tomatidine和熊果酸对1031 mRNA探针的影响，其信号被tomatidide显著改变。重点介绍了一些感兴趣的mRNA。
图6。
图6。
乌索酸和托马替丁显著诱导或抑制衰老骨骼肌中的许多基因集，包括ATF4抑制基因集激活。 A类和B类，对图5中的阵列数据进行基因集富集分析。统计显著性定义为对<0.05，FDR<0.25。A类与对照组小鼠相比，熊果酸处理的小鼠和tomatidine处理的小鼠股四头肌中均显著诱导了反应基因集。B类与对照组小鼠相比，熊果酸处理的小鼠和tomatidine处理的小鼠股四头肌中的反应基因组均受到显著抑制。C类和天，数据来自图2中22个月龄C57BL/6小鼠的股四头肌，这些小鼠接受了2个月的对照饮食、熊果酸饮食或tomatidine饮食。C类，用qPCR评估指示转录物的水平。数据为每种情况下五只小鼠的平均值±S.E。天用抗4E-BP1或抗磷酸-4E-BP1抗体对股四头肌蛋白提取物进行免疫印迹分析。左侧，代表性免疫印迹。用Ponceau S对膜进行染色，以确认负载均匀。赖特，4E-BP1总量的量化。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E.InC类和天,对通过Dunnett的多重比较试验，采用单因素方差分析确定值。*，对≤ 0.05.TCA公司，三羧酸；hnRNP公司异质核核糖核蛋白；CDK公司细胞周期蛋白依赖性激酶；APC/C公司,后延复合体/环体；SRP、，信号识别粒子；乘员防护控制器，原产地识别复合体；AP公司,无嘌呤/无嘧啶。
图7。
图7。
ATF4减少骨骼肌蛋白质合成。 A–C，我们使用2个月大的雄性C57BL/6小鼠，用20μg空质粒（pcDNA3；对照）转染一块胫骨前肌，用20微克pcDNA3-编码FLAG-tagged ATF4（p-ATF4-FLAG）的对侧胫前肌转染。A类和B类转染后第3天采集双侧胫前肌。A类用抗FLAG和抗4E-BP1抗体对胫骨前蛋白提取物进行免疫印迹分析。左侧、代表性免疫印迹和Ponceau S染色。赖特，4E-BP1的量化。数据为九只小鼠的平均值±S.E。B类，qPCR分析Eif4ebp1mRNA。数据为四只小鼠的平均值±S.E。C类转染后3天腹腔注射嘌呤霉素，30分钟后采集双侧胫骨前肌，然后用抗嘌呤菌素抗体对胫骨前蛋白提取物进行免疫印迹分析，以评估骨骼肌蛋白质合成。左侧，合并嘌呤霉素的定量。数据为五只小鼠的平均值±S.E。赖特、代表性免疫印迹和Ponceau S染色。天用表达GFP的重组腺病毒（对照组）、GFP加FLAG标记的ATF4或GFP加全长转录不活跃的FLAG标记ATF4构建物（ATF4ΔbZIP）感染完全分化的C2C12肌管48小时。左侧、代表性的抗FLAG和抗4E-BP1免疫印迹和Ponceau S染色。中间，qPCR分析Eif4ebp1mRNA。数据为六个重复/条件的平均值±S.E。赖特，4E-BP1的量化。数据为四个重复/条件的平均值±S.E。E类，通过用表达GFP加ATF4ΔbZIP或GFP加FLAG标记的ATF4的重组腺病毒感染C2C12肌管48小时来评估肌管蛋白合成，然后测量[三H] 亮氨酸并入总细胞蛋白。数据为五个实验的平均值±S.E。在A–E,对值是用t吨测试(A–C和E类)或使用Dunnett的多重比较测试进行单因素方差分析(天). *,对< 0.05; **,对<0.01；***，对< 0.001.误差线表示平均值±S.E。
图8。
图8。
老年骨骼肌中ATF4表达的靶向减少增加了肌肉蛋白质的合成。 A–C，我们比较了22个月大的雄性ATF4 mKO小鼠的体重匹配队列(即ATF4(L（左）/L（左）);MCK Cre公司(Tg（千克）/0)老鼠）和自动变速箱4(L（左）/L（左）);MCK-Cre公司(0/0)窝友控制小鼠。A类，使用小鼠Ref-8 2.0版BeadChip阵列分析股四头肌mRNA。n个=每个基因型8个阵列。通过归一化对数确定ATF4 mKO对单个探针信号的影响2ATF4 mKO小鼠发出的信号2来自对照小鼠的信号。统计显著性被任意定义为对≤ 0.025. 数据显示，相对于对照肌肉，ATF4 mKO肌肉中的20 mRNA水平降低最多；一些mRNA有两个对数2因为它们由数组上的两个探测表示。星号指出FDR分析也认为显著减少的探针(即FDR≤0.1）。B类，股四头肌蛋白提取物用抗4E-BP1和抗磷酸-4E-BP1进行免疫印迹分析。左侧、代表性免疫印迹和Ponceau S染色。赖特，总4E-BP1的定量。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E。C类通过腹腔注射嘌呤霉素，30min后采集股四头肌，然后用抗嘌呤菌素抗体进行免疫印迹分析，评估骨骼肌蛋白质合成。左侧、代表性免疫印迹和Ponceau S染色。赖特，合并嘌呤霉素的定量。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E.InB类和C类,对值是用t吨测验。FilGAP公司,丝氨酸A结合GTPase激活蛋白。
图9。
图9。
靶向性减少骨骼肌ATF4表达可减少与年龄相关的肌肉无力和萎缩。 A–F，我们比较了22个月大的雄性ATF4 mKO小鼠和同窝对照小鼠的体重匹配队列。A类双侧股四头肌和肱三头肌的总重量。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E。B类，股四头肌横截面的代表性H&E图像。C类，股四头肌IIb型和IIx型纤维的平均直径。每个数据点代表一只老鼠的IIb或IIx型光纤的平均直径，以及水平钢筋表示平均值±S.E.的平均值。天，所有IIb型光纤的尺寸分布C.E公司,体内前肢握力。每个数据点代表一只鼠标五次测量的平均值，以及水平钢筋表示平均值±S.E.的平均值。F类,体外指长伸肌产生的特定强直力。每个数据点代表一个鼠标，并且水平钢筋表示平均值±S.E.InA类,C类,E类，以及F类,对值是用t吨测验。千牛，千牛顿。
图10。
图10。
老年骨骼肌中熊果酸和tomatidine产生的基因表达变化中，只有一小部分需要ATF4。 A类和B类，数据来自图5和8中描述的微阵列研究。A类，散点图显示了附件4四头肌mRNA基因缺失，其水平被熊果酸显著改变。B类，散点图，显示附件4四头肌mRNA基因缺失，其水平被托马替丁显著改变。
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