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.2015年9月；125(9):3461-76.
doi:10.1172/JCI79964。 Epub 2015年8月4日。

克鲁珀样因子4对心肌线粒体稳态的转录控制至关重要

廖旭东, 张荣丽, 袁璐, 多梅尼克·A·普罗斯多西莫, Panjamaporn桑旺, 张丽蕾, 广州, 普尼特·阿南德, 凌来, 特蕾莎·C·利昂, 藤冈久志, 方烨, 玛丽安娜·G·罗斯卡, 查尔斯·霍佩尔, P克里斯蒂安·舒尔茨, E Dale Abel公司, 乔纳森·斯塔姆勒, 丹尼尔·普·凯利, 穆克什·K·贾恩

Kruppel样因子4对心脏线粒体稳态的转录控制至关重要

廖旭东等。 临床研究杂志. 2015年9月.

摘要

线粒体内稳态对组织健康至关重要，线粒体功能障碍可导致多种疾病，包括心力衰竭。在这里，我们已经证明转录因子克鲁珀样因子4（KLF4）控制线粒体的生物发生、代谢功能、动力学和自噬清除。患有心肌特异性Klf4缺乏症的成年小鼠随着年龄增长或压力过载而出现心脏功能障碍，其特征是心肌ATP水平降低，ROS升高，线粒体形状、大小、超微结构和排列发生显著变化。对从KLF4缺乏心脏分离的线粒体进行评估，结果显示呼吸速率降低，这可能是由于电子传递链复合物I缺陷所致。此外，心脏特异性胚胎KLF4缺失导致出生后过早死亡，线粒体生物发生受损，线粒体成熟度改变。我们确定KLF4与雌激素相关受体/PPARγ辅激活子1（ERR/PGC-1）转录调控模块在代谢和线粒体靶点上的最佳功能结合、协同并必需。最后，我们发现KLF4通过转录调节心肌细胞中广泛的自噬基因来调节自噬流量。总之，这些发现确定KLF4是线粒体稳态的节点转录调节器。

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数字

图9
图9。KLF4在代谢和线粒体基因调节中的作用模型。
KLF4通过（i）与ERR/PGC-1转录模块合作调节代谢和线粒体基因，以及（ii）独立于ERR/PCC-1模块直接调节自噬基因，从而充当心脏线粒体稳态的关键转录调节器。X、 其他转录因子。
图8
图8。KLF4调节心脏的自噬。
(A类)LC3激活的蛋白质印迹分析（LC3-I到LC3-II的转化）。(B类)心脏中PINK1/parkin通路的激活。将来自MG132处理细胞的样本作为阳性对照。线粒体膜蛋白TOM20作为负荷对照。(C类)心脏中ULK1信号的激活（顶部）和NRVM（底部）。p-ULK1，p-Ser555。术后3天采集心脏样本。NRVM感染指示腺病毒72小时，然后用20μmol/l CCCP加或不加100 nmol/l BFA治疗2小时。(D类)KLF4诱导的自噬通量依赖于ULK1。(E类)的表达式乌尔克1NRVMs中KLF4过度表达或敲低的mRNA。(F类)乌尔克1启动子截断分析。(G公司)KLF4招募至乌尔克1近端启动子区。箭头表示ChIP测定中的PCR区域。(H（H）和我)自噬途径qPCR阵列分析。n个= 3 (E类——我). *P（P）<0.05，学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。
图7
图7。KLF4是ERR/PGC-1复合物最佳转录功能所必需的。
(A类和B类)KLF4是PGC-1α介导的(A类)代谢和(B类)NRVM中的线粒体基因。(C类)KLF4缺乏损害NRVM中PGC-1α介导的线粒体生物发生。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。(D类)KLF4/ERR/PGC-1转录复合物的拟议机制模型。
图6
图6。KLF4和ERR/PGC-1模块之间的相互作用和协作性。
(A类)全长和截短的KLF4蛋白。TAD，交易激活域；TRD，反阻遏结构域。(B类和C类)全长ERRα（FLAG-tagged）和不同形式截短KLF4（HA-taged）之间的蛋白质相互作用。(D类)全长和截短ERRα蛋白。DBD，DNA-结合域；LBD，配体结合域。(E类和F类)全长KLF4（HA标记和内源性KLF4）和不同形式的截短ERRα（FLAG标记）之间的蛋白质-蛋白质相互作用。(G公司)ERRα/PGC-1α复合物与不同形式截短KLF4之间的功能协同性。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。
图5
图5。KLF4与ERR/PGC-1转录模块结合并协同调节靶基因转录。
(A类)KLF4向内源性细胞的募集周期启动子和启动子报告子的激活。黑色矩形表示KRE，白色矩形表示NRRE。箭头表示ChIP分析中的PCR区域。(B类和C类)KLF4与ERR/PGC-1复合物在靶向启动子上的协同合作性。(D类)启动子截断分析。(E类)中的位点突变周期发起人。(F类)KLF4与PGC-1α/PGC-1β/ERRα之间的蛋白质相互作用。(G公司)凝胶过滤色谱分析。(H（H）)KLF4增加ERRα向内源性的募集周期NRVM中的启动子。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。
图4
图4。心肌KLF4是出生后线粒体生物发生和心脏成熟所必需的。
(A类)的表达式KLF4型和PPARGC1A公司在人类和老鼠的心中。将产前数据用作对照。n个=每个数据点4。(B类)心脏大小和重量。(C类)心脏收缩力，通过超声心动图评估。(B类和C类)n个在4周龄时为5–7。(D类)心肌超微结构。显示了具有代表性的图像(n个=每组3人）。比例尺：1μm。(E类)qPCR评估的心脏线粒体基因组DNA。线粒体基因组拷贝（mtDNA）归一化为核DNA含量。n个每种基因型=10。Dots显示5对引物的qPCR结果(mt-Nd1号，mt-Nd4号，mt-Co1型，二氧化硫（mt-Co2）、和mt-Atp6型)。(F类)线粒体基因组编码的基因的表达。恩杜夫布5作为对照。(G公司)线粒体和细胞核编码基因的蛋白质水平。每条车道代表一种动物。(H（H）)急性击倒或(我)NRVMs中KLF4的过度表达影响线粒体编码基因的表达。考克斯5b，一种核编码基因，作为对照。(J型)心脏KLF4缺乏损害调节线粒体动力学的基因表达。心脏样本：n个= 10. NRVM样本：n个= 3. 对2周龄的动物进行DNA/RNA/蛋白质分析*P（P）<0.05，学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。
图3
图3。老年KLF4缺乏心脏的心脏功能障碍和受损线粒体的积聚。
(A类)A-cKO小鼠的心脏功能随着年龄的增长而下降。n个= 4. *P（P）<0.05，学生的吨使用Bonferroni校正进行测试。(B类)缩短A-cKO小鼠的寿命。n个A-cKO组=18，n个=每个对照组（A-Cre和Klf4公司飞行/飞行)。通过对数秩检验、A-cKO与A-Cre和Klf4公司飞行/飞行. (C类)9月龄小鼠心脏线粒体超微结构。代表性图像来自3对小鼠。方框区域以高倍显示。在高倍图像中，白色箭头表示线粒体健康，黑色箭头表示线粒体受损，变性（苍白）和碎裂（小而圆）。比例尺：2μm（低倍图像）；0.5μm（高倍图像）。
图2
图2。KLF4缺乏损害线粒体功能和心肌生物能量学。
(A类)用脂肪酸和丙酮酸底物进行线粒体呼吸测定。苹果酸被用作NADH供体。(B类)ETC复合物活性测定。提供的数据来自5个独立实验。(C类)AMPKα磷酸化的Western blotting分析。p-AMPKα，p-Thr172。(D类和E类)用NRVM进行细胞呼吸测定(D类)急性腺病毒击倒或(E类)KLF4的过度表达。提供葡萄糖（25 mmol/l）和丙酮酸（1 mmol/l）作为底物。OCR，耗氧率；Sh-EV，shRNA靶向空载体；Sh-KLF4，shRNA靶向Klf4公司; FCCP，第页-三氟甲氧基苯腙；腐烂、鱼藤酮；AA，抗霉素A；腺病毒空载体；Ad-KLF4，腺病毒KLF4。最大呼吸速率等于FCCP诱导的耗氧速率。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的吨测试。
图1
图1。KLF4对心脏压力过载的生物能量和功能适应是必需的。
(A类)左室功能、心脏重量（HW）、肺重量（LW）和心脏中肥厚标记基因的表达。BW，体重。(B类)微阵列分析。热图显示了A-Cre和A-cKO小鼠之间假手术组的边际差异，但TAC组的显著差异。对TAC组差异表达的基因（1.5倍以上的倍数变化，A-cKO与A-Cre小鼠）进行基因富集分析。ES，浓缩分数。(C类)一些心脏代谢和线粒体基因的qPCR分析。n个=假手术组为4，n个=7，对于A-Cre TAC组，n个=5，对于A-cKO TAC组。(D类)心肌ATP水平。(E类)通过DHE染色评估心肌ROS水平。比例尺：20μm。(F类)通过透射电镜（TEM）评估心肌超微结构，显示TAC后线粒体损伤。比例尺：2μm。代表性图片(n个=3）。在假手术和TAC手术后3天进行测量。#P（P）假手术组间<0.05*P（P）TAC组和Student组之间<0.05吨使用Bonferroni校正进行测试。
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中的注释

  • 无Krüppel的畸形线粒体。
    Jang C，Arany Z。 Jang C等人。 内分泌代谢趋势。2015年11月；26(11):587-589. doi:10.1016/j.tem.2015.08.004。Epub 2015年9月21日。 内分泌代谢趋势。2015 PMID：26404663 免费PMC文章。

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