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.2015年7月29日；10（7）：e0129743。
doi:10.1371/journal.pone.0129743。 2015年电子收集。

NOX1或NOX4缺乏通过抑制肝星状细胞活化预防小鼠肝脏炎症和纤维化

田兰 1, 塔蒂亚娜·基塞莱娃 2, 大卫·A·布伦纳 2
附属公司

NOX1或NOX4缺乏通过抑制肝星状细胞活化预防小鼠肝脏炎症和纤维化

田兰等。 公共科学图书馆综合版. .

摘要

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）产生的活性氧（ROS）在肝损伤和纤维化中起着关键作用。先前的研究表明，GKT137831是一种双重NOX1/4抑制剂，可减轻小鼠的肝纤维化以及肝星状细胞（HSC）中的促纤维化基因和肝细胞凋亡。NOX1和NOX4缺乏在肝纤维化中的作用尚不清楚，并且从未进行过直接比较。HSC是肝纤维化发病机制中的主要肌成纤维细胞。因此，我们旨在确定NOX1和NOX4在肝纤维化中的作用，并研究NOX1与NOX4信号是否通过调节HSC活化而介导肝纤维化。用四氯化碳（CCl4）处理小鼠以诱导肝纤维化。与野生型小鼠相比，NOX1或NOX4缺乏可减轻CCl4后的肝损伤、炎症和纤维化。NOX1或NOX4缺乏降低肝纤维化小鼠的脂质过氧化和ROS生成。NOX1和NOX4缺乏在预防小鼠肝损伤方面几乎同样有效。NOX1/4双抑制剂GKT137831抑制原代小鼠HSC中由脂多糖（LPS）、血小板衍生生长因子（PDGF）或声波刺猬（Shh）诱导的ROS生成以及炎症和增殖基因。此外，NOX1和NOX4敲除激活的HSC（在塑料上培养5天）中增殖和原纤维化基因的mRNA下调。最后，与正常对照组相比，肝硬化患者肝脏中NOX1和NOX4蛋白水平升高。因此，NOX1和NOX4信号传导介导肝纤维化的发病机制，包括HSC的直接激活。

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数字

图1
图1。CCl后NOX1KO和NOX4KO小鼠的肝纤维化减轻4受伤。
通过12次CCl灌胃给药，从WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠获得肝脏46周，每周两次。（A） 显示了天狼星红染色、结蛋白和α-SMA免疫组织化学染色的代表性图像。原始放大倍数X4和X10。（B） 肝组织中α-SMA的免疫印迹。（C） 通过ALT和AST评估肝功能。（D） 天狼星红染色的形态计量分析定量和结蛋白和α-SMA的免疫化学。（E） CCl后检测WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠肝纤维化基因的mRNA4通过定量实时PCR进行处理。HPRT被用作内部控制。与对照小鼠相比，数据显示为折叠mRNA诱导*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01.
图2
图2。CCl后NOX1KO和NOX4KO小鼠的肝损伤和炎症减轻4受伤。
通过12次CCl灌胃给药，从WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠获得肝脏46周，每周两次。（A） 肝切片H&E染色和F4/80免疫组织化学染色（C）定量。原始放大倍数X10。（C） CCl后在WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠中检测炎症基因的肝脏mRNA4通过定量实时聚合酶链式反应检测损伤。HPRT被用作内部控制。与对照小鼠相比，数据显示为折叠mRNA诱导*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01.
图3
图3。CCl后NOX1KO和NOX4KO小鼠与WT小鼠相比，脂质过氧化作用减弱4受伤。
通过12次CCl灌胃给药，从WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠获得肝脏46周，每周两次。（A） 4-羟基壬醛（4-HNE）免疫荧光染色的代表性图像及其定量（B）。原始放大倍数X10。（C） 采用硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定法测定肝脏丙二醛水平*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01.
图4
图4。在血管紧张素II刺激下，HSC中的NOX1/4抑制减弱了ROS生成。
（A） 将来自WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠的HSC加载H2DCFDA（10μM）20分钟。然后清洗细胞，然后用Ang II（10-6M） ●●●●。ROS生成通过使用荧光计连续定量60分钟的荧光信号进行评估。（B） HSC ROS生产的代表性图像。原始放大倍数X10。
图5
图5。GKT137831对LPS、PDGF和Shh刺激引起的HSC ROS生成和基因表达减弱。
（A） 用H2DCFDA（10μM）负载从WT小鼠分离的HSC 20分钟。然后清洗细胞，然后在有或无GKT137831（5μM）的情况下用LPS（100 ng/ml）、PDGF（10 ng/ml）和Shh（1μg/ml）诱导细胞。ROS生成通过使用荧光计连续定量60分钟的荧光信号进行评估。（B） GKT137831在HSC中减弱趋化因子基因，以应对LPS。将分离自WT小鼠的HSC用GKT137831（20μM）预处理30 min，然后用LPS（100 ng/ml）处理6 h。通过实时定量PCR分析趋化因子基因**P（P）< 0.01, ***P（P）与对照组相比，<0.001#P（P）< 0.05, ##P（P）与LPS相比<0.01。（C） 在HSC中，GKT137831对PDGF的反应使增殖基因减弱。将分离自WT小鼠的HSC在GKT137831（20μM）存在或不存在的情况下用PDGF（10 ng/ml）处理24 h。通过实时定量PCR分析增殖基因**P（P）与对照组相比<0.01#P（P）< 0.05, ##P（P）与PDGF相比<0.01。（D） GKT137831对刺猬配体Shh的反应使HSC中的刺猬基因减弱。在存在或不存在GKT137831（20μM）的情况下，用Shh（1μg/ml）处理从WT小鼠分离的HSC 24和48小时。通过定量实时PCR分析Hedgehog基因。HPRT被用作内部控制**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与对照组相比##P（P）< 0.01, ###P（P）<0.001 vs Shh。
图6
图6。肝损伤和PDGF导致NOX1和NOX4缺乏，从而降低HSC的增殖。
（A） CCl后NOX1KO和NOX4KO小鼠HSC增殖减少4受伤。PCNA免疫荧光显微镜显示肝HSC增殖。Desmin是HSC的特定标记（红色）。PCNA是增殖的标志（绿色）。原始放大倍数X10。（B） 缺乏NOX1和NOX4的HSC在PDGF（10 ng/ml）作用24小时后增殖减少。Ki67（红色）免疫荧光显微镜显示增殖性HSC。细胞核由DAPI（蓝色）呈现。原始放大倍数X10。（C） 体内PCNA-阳性HSC图。（D） 体外Ki67阳性HSC图。
图7
图7。NOX1和NOX4均介导HSC的增殖和纤维生成反应。
来自WT、NOX1KO和NOX4KO小鼠的HSC在DMEM中用10%FBS培养1天（静止HSC）和5天（激活HSC）。用实时定量PCR检测增殖基因（A）和纤维生成基因（B）的mRNA表达。HPRT被用作内部控制*P（P）<0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001 vs激活的WT HSC控制。
图8
图8。肝硬化患者的NOX1和NOX4蛋白水平升高。
通过天狼星红染色和NOX1和NOX4抗体免疫荧光分析来自对照组（N=7）和肝硬化患者（N=10）的人类肝脏。图表显示了染色或免疫荧光阳性区域的百分比，表示为平均值+S.D.，对照组与纤维化组的每次比较p<0.05。
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