A Dynamic Search Process Underlies MicroRNA Targeting

doi:10.1016/j.cell.2015.06.032

.2015年7月2日；162(1):96-107.

doi:10.1016/j.cell.2015.06.032。

微RNA靶向的动态搜索过程

斯坦利·德·钱德拉多斯¹, 妮可·T·席尔^#², 马尔维娜·什切帕尼亚克^#¹, 伊恩·麦克雷², Chirlmin Joo先生¹

附属公司

¹荷兰代尔夫特理工大学生物纳米科学系科维利纳米科学研究所，荷兰代尔夫特洛伦茨韦格1号，2628 CJ。
²斯克里普斯研究所综合结构与计算生物学系，美国加利福尼亚州拉霍亚市托里松树北路10550号，邮编92037。

^#贡献均等。

PMID： 26140593
预防性维修识别码：项目经理4768356
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2015.06.032

微RNA靶向的动态搜索过程

斯坦利·德·钱德拉多斯等。单元格. 2015.

.2015年7月2日；162(1):96-107.

doi:10.1016/j.cell.2015.06.032。

作者

斯坦利·德·钱德拉多斯¹, 妮可·T·席尔^#², 马尔维娜·斯泽帕尼亚克^#¹, 伊恩·麦克雷², Chirlmin Joo先生¹

附属公司

¹荷兰代尔夫特理工大学生物纳米科学系科维利纳米科学研究所，荷兰代尔夫特洛伦茨韦格1号，2628 CJ。
²斯克里普斯研究所综合结构与计算生物学系，美国加利福尼亚州拉霍亚市托里松树北路10550号，邮编92037。

^#贡献均等。

PMID： 26140593
预防性维修识别码：项目经理4768356
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2015.06.032

摘要

精氨酸蛋白在通过microRNAs（miRNAs）介导转录后基因调控中起着核心作用。精氨酸类使用miRNAs中的核苷酸序列作为识别靶信使RNA进行抑制的指南。在这里，我们使用单分子FRET直接可视化人类精氨酸-2（Ago2）如何搜索和识别RNA中的靶位点，以补充其miRNA指南。我们的结果表明，Ago2最初扫描与miRNA的核苷酸2-4互补的靶位点。当靶互补延伸到核苷酸2-8时，这种初始的短暂相互作用传播为稳定的结合。这种逐步识别过程与Ago2沿着靶RNA的横向扩散相耦合，这通过增强Ago2在RNA上的保留来促进靶搜索。综合结果揭示了Argonaute可能用于有效识别活细胞中大量动态聚集RNA分子内miRNA靶位点的机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。Ago2-miRNA靶点识别的单分子观察**
（A）单分子FRET分析的图解表示。（B） miRNA和靶RNA的序列N个（miRNA和靶RNA之间匹配区域的长度）等于6 nt。供体荧光团（Cy3）位于miRNA的第9 nt（从miRNA的5′端算起），受体（Cy5）位于靶RNA上与miRNA的nt 17相对的位置。垂直线表示引导物和靶之间的相邻碱基对。点“.”表示不连续的一对。（C） CCD图像（供体通道）显示Ago2-miRNA与靶RNA结合。单个斑点代表单分子复合物。（左）具有代表性的实验结果N个= 6. （中）与左侧相同，但不包括Ago2。（右）U₆₃作为阴性对照，同时加入Ago2。比例尺5µm。（D）对于[C]中的三种情况，作为时间函数绘制的累积结合事件的数量。（E）获得的荧光时间轨迹（分辨率为100 msec）显示了Ago2-miRNA在微流控室中单个点的三次对接和解离事件。黑色箭头表示Ago2-miRNA与靶mRNA的结合。灰色箭头表示分离。（F）由125条单分子轨迹拟合高斯函数得到的FRET直方图。（G）结合停留时间（Δτ）用单指数衰减拟合。数据的第一列未包含在分析中，以避免因时间分辨率的限制而产生潜在的人工制品。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准偏差（std）。箱子大小为1秒。另请参见图S1。

**图2。微RNA靶点识别动力学**
（A） miRNA序列和具有不同值的靶RNAN个垂直线表示引导RNA和目标RNA之间的连续基础比对。冒号“：”表示潜在的GU摆动对。点“.”表示不连续的对。“p”表示miRNAs指南中的5′磷酸盐。靶RNA 3′端的生物素用“b”表示。miRNA的序列N个=19是hsa-let-7a。其他miRNAs序列来自hsa-let-7a，在5′端和3′端有变异。miRNA的序列N个=3和4包含A，而不是nt 6的基因组序列U。miRNA的序列N个＝7在nt 9处包含A而不是基因组序列U，并且具有在nt 10处缀合的染料。（B）靶RNA与Ago2-miRNA复合物相互作用的代表性时间轨迹N。阴性对照组的时间分辨率为100毫秒N个= 3^{（第5-7页）}, 3^{（第2-4页）}、4、5和6。300毫秒的时间分辨率用于N个=7、8、15和19。（C）不同值的停留时间直方图N个.的驻留时间（Δτ）N个= 3^{（第5-7页）}, 3^{（第2-4页）}、4、5和6分别为0.2±0.1、0.7±0.2、0.8±0.1、1.2±0.3和1.9±0.1秒。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准值。垃圾箱尺寸N个= 3^{（第5-7页）}为0.5秒N个= 3^{（第2-4页）}、4、5和6为1秒N个=7、8、15和19因光漂白而未确定（N.D.）。由于缺少绑定事件，阴性对照的驻留时间不可用（N.A.）。（D）条形图显示了停留时间与N。红色虚线表示观察时限（300秒），该时限受到光漂白的限制。误差线是在不同日期进行的3个独立实验的标准值。（E）绘制不同值的结合率N个在所有情况下，将1 nM Ago2-miRNA导入培养箱。误差条是不同日期的3个独立实验的标准。另请参见图S2和表S1。

**图3。Ago2-miRNA的侧向扩散**
（A）图示为单分子FRET分析的示意图，该分析用于观察Ago2-miRNA在解离发生之前在串联结合位点之间的横向扩散。N个₁和N个₂分别是miRNA与位点1和2之间的匹配序列的长度。（B）的序列N个₁=N个₂=6个配对的靶位点，用于指导miRNA。供体（Cy3）位于miRNA的第9 nt。受体（Cy5）位于配对miRNA的nt17对面的1号位点。当miRNA与1号位点结合时，两个染料相隔7 nt，导致FRET高(E类~ 0.75). 当它绑定到站点2时，它们被隔开13 nt，导致FRET较低(E类~ 0.5). （C）以100毫秒的时间分辨率获得的时间轨迹中的荧光信号报告Ago2-miRNA的对接和解离。FRET信号的强度指示Ago2-mi RNA复合物相对于位点1和2的位置（位点1，高FRET；位点2，低FRET）。（D）（左上）FRET直方图与两个高斯函数拟合(E类~0.5和0.75）。总粘结（Δτ，右上角）、粘结到场地2（ΔTau）的停留时间分布₂，左下角），并绑定到站点1（Δτ₁，右下角）。分布符合单指数衰减。数据的第一列未包含在分析中，以避免有限时间分辨率的人工制品。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准偏差。箱子尺寸为1秒。（E）条形图显示了停留时间（Δτ₁和Δτ₂)取决于miRNA和每个结合位点之间的匹配区域的长度。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准偏差。参见图S3和表S1。

**图4。检测侧向扩散的三色FRET分析**
（A）图示为用于观察Ago2-miRNA在串联结合位点之间横向扩散的单分子三色FRET分析的示意图。N个₁和N个₂分别是miRNA和位点1和2之间匹配序列的长度。将等量的Cy3（绿色，供体1）和Cy5（红色，供体2）标记的miRNA添加到具有Cy7（蓝色，受体）标记的串联靶结构固定的腔室中。（B）的序列N个₁=N个₂=6个配对的靶位点，用于指导miRNA。供体（Cy3或Cy5）位于miRNA的第9个nt。受体（Cy7）位于配对miRNA的nt17对面的位点1。（C）时间轨迹中的荧光信号以500毫秒的时间分辨率获得。（左）显示Cy3-Cy7 FRET效率变化的时间轨迹。（右）显示Cy5-Cy7 FRET效率变化的时间轨迹。FRET效率图中的水平线表示两种不同的FRET状态。

**图5。两个相邻靶点的协同效应**
（A）使用单靶结构获得的荧光时间轨迹(N个=6）在存在10%PEG的情况下，时间分辨率为300毫秒。（B） [A]中使用的条件的停留时间直方图。停留时间（Δτ）为10.5±2.7秒。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准值。箱子大小为20秒。（C）使用串联目标构造获得的荧光时间轨迹(N个₁ *=N个*₂=6）在存在10%PEG的情况下，时间分辨率为300毫秒。（D）使用双指数曲线（绿色）拟合[C]中所用条件的驻留时间直方图。双指数拟合导致两个特征时间Δτ₁（61%），13.9±1.7s，蓝色曲线；Δτ₂（39%）=76.0±22.7s，黄色曲线）。平均值<Δτ>=31.4±8.4秒，根据Δ₁× 61% + Δτ₂× 39%. Δτ>900（sec）时的峰值是由于观测时间有限，在拟合过程中未包括在内。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准偏差。箱子尺寸为20秒。（E）绘制不同浓度（重量与体积）聚乙二醇的总停留时间。误差是三个独立实验的标准。另请参见图S5。

**图6。PAZ结构域在侧向扩散中的作用**
（A）时间分辨率为300毫秒的时间轨迹显示了两个结合位点之间发生的横向扩散(N个₁，FRET高；N个₂，低FRET，每15 nt）。（B）在[A]条件下获得FRET直方图，并用高斯函数拟合(E类~0.5和0.75）。（C）使用在其3′端用生物素修饰的miRNA构建物，获得时间分辨率为300毫秒的时间轨迹。(N个₁，FRET高；N个₂，低FRET，每15 nt）。（D）在[C]条件下获得FRET直方图，并用高斯函数拟合(E类~0.5和0.75）。（E）两个结合位点之间穿梭的动力学速率(N个₁和N个₂)是用N个_我=6、8、“7+10”、15和19，使用未修饰和3′生物素化的miRNA结构。误差是在不同日期进行的3个独立实验的标准偏差。另请参见图S4。

**图7。人类Ago2-miRNA的目标搜索与识别模型**
（A） Ago2-miRNA识别靶点的拟议步骤说明。Ago2-miRNA结合单链靶RNA，并沿着RNA快速扩散，在不到100毫秒的时间内滑过69nt（我们的靶构建体的长度）（我们的时间分辨率）。的补充站点N个≥3导致复合体暂停并保持元静态绑定（约1秒）。当位点互补性延长种子的全长（nt 2–8）或更长时，复合体在延长的时间内保持稳定结合（>>300秒）。另请参见图S6。

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