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.2015年11月；63(11):2040-2057.
doi:10.1002/glia.22876。 Epub 2015年6月29日。

肠神经胶质细胞表达蛋白脂质蛋白1，是哺乳动物神经系统中唯一的胶质细胞转录群体

梅纳克希·拉奥 1 2 三, 布拉德利·D·奈姆斯 2, 劳伦·东 三, 维维亚娜·萨利纳斯-里奥斯 1, 迈克尔·拉特林 4, 迈克尔·D·格尔森 5, 加布里埃尔·科尔法斯 1 6 7
附属机构

肠神经胶质细胞表达蛋白脂质蛋白1，是哺乳动物神经系统中唯一的胶质细胞转录群体

梅纳克希·拉奥等人。 格利亚. 2015年11月.

摘要

在肠神经系统（ENS）中，胶质细胞的数量是神经元的4倍，并在整个胃肠道形成广泛的网络。越来越多的证据表明，肠神经胶质在肠功能中发挥着重要作用，因此有必要更好地了解其分子标记物的表达，以及它们与神经系统其他部位的神经胶质之间的关系。我们分析了ENS中星形胶质细胞和少突胶质细胞标记物的表达，意外地发现，蛋白脂质蛋白1（PLP1）在成年小鼠肠道中由胶质细胞特异性表达。PLP1和S100β是肠神经胶质细胞最广泛表达的标记物，而胶质纤维酸性蛋白的表达更受限制。除了细胞位置和形态外，标记表达还可区分肌内肠神经胶质细胞的特定亚群，这表明分子标记的组合代码可用于识别不同的亚型。为了评估肠内和肠外胶质细胞之间的相似性，我们对小鼠肠道中PLP1表达细胞进行了RNA测序分析，并将其基因表达模式与其他类型胶质细胞的基因表达模式进行了比较。该分析表明，肠神经胶质细胞在转录上是独特的，与神经系统中的其他细胞类型不同。肠神经胶质细胞表达髓鞘神经胶质细胞、雪旺细胞和少突胶质细胞的许多特征基因，尽管在小鼠ENS中没有髓鞘形成的证据。glia 2015；63:2040-2057.

关键词：RNA-Seq；肠神经系统；胃肠道；神经胶质细胞。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。PLP1在小鼠肠道中表达，并与在PLP1启动子控制下表达的eGFP共定位
（A，D）P28处PLP1-eGFP转基因小鼠肠道横截面中PLP1蛋白的免疫染色。（B，E）eGFP荧光和蓝色DAPI核染色。（C，F）合并图像。方框区域在相应图像下方以较高的放大倍数显示。比例尺表示50μm（面板A–F）或20μm（板A′–F′）。
图2
图2。PLP1和S100β在成年小鼠肠道中共同表达
（A，D，G）在P56的PLP1 eGFP转基因小鼠肠道中的eGFP荧光，DAPI核染色为蓝色。（B，E，H）S100β免疫染色（C，F，I）合并图像。在相应图像下方高倍放大显示的方框区域显示，大多数表达PLP1的胶质细胞共同表达S100β，但存在罕见的GFP+S100β细胞−(*). 比例尺表示50μm（面板A–I）或14μm（板G′–I′）。
图3
图3。S100β由大多数PLP1表达细胞表达，而GFAP表达更有限
对PLP1-eGFP小鼠P56的连续肠道横截面进行S100β或GFAP免疫染色。然后从每只动物每个肠段的10个横截面中计数表达eGFP和/或S100β或GFAP的细胞数量（n=3只小鼠；平均值±s.e.m；通过非配对t检验获得的p值）。
图4
图4。GFAP在PLP1表达细胞的子集中表达
PLP1-eGFP转基因小鼠P56处的（A，D，G）eGFP荧光，DAPI核染色为蓝色。（B，E，H）GFAP免疫染色（C，F，I）合并图像。在相应图像下方以较高放大倍数显示的方框区域显示，环形肌中许多节外型表达PLP1的胶质细胞表现出低（*）或无可检测（箭头）的GFAP免疫反应性。比例尺表示50μm（面板A–I）或14μm（板G′–I′）。
图5
图5。PLP1和GFAP的表达因沿消化道近轴和放射轴的胶质位置而异
对PLP-eGFP小鼠P56处PLP1和GFAP表达的分析表明，“肌间”胶质细胞（肌间神经节内和神经节外胶质细胞分布在肌层内）沿肠长度呈现类似的标记表达模式，其中大多数表达GFAP；相反，超过50%的“肠外”胶质细胞（粘膜和粘膜下胶质细胞）表达PLP1，但不表达GFAP。将肌间胶质细胞分离为神经节内和节外区，这表明大多数节外型肌内胶质细胞也表达PLP1，但不表达GFAP。在P56（平均值±s.e.m）时，从3只PLP1 eGFP小鼠的每个肠段的10个横截面中计数所有表达一种或两种标志物的细胞。Kruskal-Wallis检验用于比较所有肠神经胶质细胞（十二指肠、回肠和结肠分别为p=0.025、0.022和0.0097）和神经节内外的肌间神经胶质细胞在6组肠段的中位数分布（十二指节、回肠、结肠分别为p=0.01、0.04和0.0096）。“总胶质细胞”是指仅表达PLP1、仅表达GFAP或同时表达这两种标记物的所有细胞的总和。
图6
图6。具有IV型形态的节外肌内胶质细胞表达PLP1和S100β，但不表达GFAP
小鼠结肠（A–C）S100β免疫染色和PLP1-eGFP荧光显示，S100β和PLP1在肌内和节间肌间神经胶质细胞中高度共定位。（D–F）GFAP免疫染色和小鼠结肠P56处的PLP1-eGFP荧光显示，PLP1和GFAP在肌间神经节内重叠表达，但节外肌内胶质细胞表达PLP1，而不表达GFAP。（G-I）用低剂量三苯氧胺处理的PLPCreERT:：LSLTd番茄小鼠结肠段中GFAP的免疫染色，以诱导PLP1表达细胞的稀疏标记。在具有I型（箭头）、II型（+）、III类（箭头）和IV型（*）形态的肠神经胶质细胞中检测到TdTomato表达。形态类型的高倍图像见补充图3。比例尺=50um。所有图像均在单个z平面上采集，位于肌间神经丛水平，取自整个结肠段的免疫染色。
图7
图7。来自PLP1的RNA+从出生后肠道分离的细胞富含肠神经胶质标记基因
（A） 用于RNA序列分析的FACS分选细胞提取RNA的RT-PCR显示，GFP中S100βmRNA富集，但Villin1不富集+分数。（B） GFP RNA-Seq数据中细胞型特异性基因表达的相对差异+与GFP相比−样品。为了避免在基因表达非常弱的情况下数值不稳定（除以0），在计算倍数富集之前，在所有测量的FPKM中添加0.01的伪计数。一般来说，这将减少估计的褶皱变化，从而提供更保守的值。
图8
图8。RNA-Seq鉴定富含肠神经胶质的基因
（A–B）根据RNA-Seq定量RT-PCR验证富含肠神经胶质的基因。（A） qPCR数据的代表性RT-PCR（B）条形图琼脂糖凝胶电泳显示，相对于Gapdh（n=6），每个基因表达水平的中位数绝对偏差为+/-1.48倍；*=p<0.05，Mann-Whitney U检验）。（C） 第21页PLP1-eGFP小鼠结肠的Entpd2免疫染色。高倍镜下紧邻各图像下方的方框区域显示，肌层中神经节内表达PLP1的胶质细胞表现出较强的Entpd2免疫反应性，而神经节外胶质细胞则较暗（*表示非胶质细胞表达Entpd2）。比例尺表示50μm（面板C–E）或11μm（板C′–E′）。
图9
图9。肠道胶质细胞转录谱与其他PNS和CNS细胞类型的全局比较
（A） 热图显示了神经胶质细胞和非神经胶质细胞类型中基因表达之间的总体相似性得分。每个单元格类型的源数据见补充表1。错误发现率（FDR）<0.1，标注在色标上。（B） 基因集富集分析（GSEA）显示了神经细胞（N）、少突胶质细胞（O）和星形胶质细胞（A）标记物在CNS细胞类型转录组（顶框）和肠神经胶质细胞（底框）中的排名。
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