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.2015年5月2日10:13。
doi:10.1186/s13064-015-0040-z。

甲基结合域3/核小体重塑和脱乙酰酶复合物调节大脑皮层神经细胞命运决定和终末分化

艾琳·诺克 1 2, 乔·佩雷拉 三 4, 帕特里克·D·伦巴第 5, 安德鲁·迪蒙德 6, 唐娜·利福德 7, 弗雷德里克·利弗西 8 9 10, 布莱恩·亨德里奇 11 12
附属公司

甲基结合域3/核小体重塑和脱乙酰酶复合物调节大脑皮层神经细胞命运决定和终末分化

艾琳·诺克等。 神经发育. .

摘要

背景：染色质修饰复合物在调节神经干细胞生物学的各个方面，包括自我更新和神经发生方面起着关键作用。甲基结合域3/核小体重塑和脱乙酰化（MBD3/NuRD）联合阻遏物复合物促进小鼠早期胚胎中多能干细胞的谱系承诺，对血液和皮肤中干细胞的稳态非常重要，但其在神经发生中的功能尚未描述。在这里，我们首次表明MBD3/NuRD功能对小鼠的正常神经发生至关重要。

结果：在发育中的小鼠中枢神经系统中，NuRD复合体的结构成分MBD3的缺失导致皮质厚度减少，皮质投射神经元亚型的正确规范缺陷和新生儿死亡。这些表型是由于PAX6+顶祖细胞输出的改变以及皮质板神经元异常的末端神经元分化程序所致。MBD3/NuRD突变体皮层产生正常数量的PAX6+顶端神经前体细胞；然而，PAX6+顶端祖细胞产生的EOMES+基底祖细胞数量减少。缺乏MBD3/NuRD活性的皮层祖细胞产生的神经元同时表达深层和上层标记物。利用激光捕获显微切割、基因表达谱和染色质免疫沉淀，我们提供了MBD3/NuRD在神经发育过程中控制基因表达模式的证据。

结论：我们的数据表明，尽管神经干细胞谱系承诺不需要MBD3/NuRD，但需要抑制祖细胞和神经元中的不适当转录，以促进适当的细胞谱系选择和分化程序。

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数字

图1
图1
特征描述百万美元3-突变体大脑。（A）E12.5、14.5、16.5和18.5胚胎野生型（WT）和突变型（MBD3 cKO）大脑苏木精染色冠状切片上的代表性MBD3免疫染色（棕色）。黑色箭头表示假定皮质板，白色箭头表示假定VZ。野生型和突变型切片在一张载玻片上同时染色，因此野生型可作为突变型切片染色的阳性对照。比例尺=100μm。（B）野生型（WT）和兆比特3cKO）胚胎。N个 = 3-6. *图14.5P（P） = 0.0192,数据流 = 2; 图16.5P（P） = 0.0001中，数据流 = 2; 图18.5P（P） = 0.0001,数据流 = 2.误差条代表标准偏差。
图2
图2
兆比特3-胚胎大脑缺陷表明EOMES+基础神经祖细胞的生成减少，神经输出减少。（A）PAX6的E14.5、E16.5和E18.5冠状脑切片的代表性免疫染色。（B）每100μm皮质长度染色细胞的定量。（C）E14.5、E16.5和E18.5冠状脑切片的EOMES代表性免疫染色和DAPI复染。（D）每100μm皮质长度染色细胞的定量。N个 = 3到6*P（P） = 0.0100,数据流 = 2（E）磷酸化组蛋白H3（pH3）的E14.5和E16.5冠状脑切片的代表性免疫染色。白色箭头表示顶端和非顶端pH3+细胞的位置。（F）定量每100μm皮质长度E14.5和E16.5处心尖表面pH3+细胞的数量，N个 = 三。（G）E14.5非心尖表面pH3+细胞数量的量化(P（P） = 0.067,数据流 = 2） 和E16.5处，N个 = 3, *P（P） = 0.029,数据流 = 2.误差条代表标准偏差比例尺=100μm。
图3
图3
Mbd3cKO小鼠产生的分化细胞较少。（A）在指定的时间点检查胚胎前24小时，给怀孕小鼠注射单脉冲BrdU。分化细胞输出被定义为24小时内VZ外产生的强BrdU（++）/PAX6−细胞的数量。BrdU（红色）和PAX6（绿色）的E14.5和E16.5冠状脑切片的代表性免疫染色。白线表示VZ和VZ外部（非VZ）之间的假定边界。底部面板是上图中方框区域的放大图像。绿色、红色和黄色箭头分别指示PAX6 only+、strong BrdU only+和PAX6/BrdU双阳性细胞。（B）量化24小时内产生的分化神经元数量。比例尺=100μm；N个 = 3至6*P（P） = 0.0134,数据流 = 2.误差条表示标准偏差。比例尺=100μm。
图4
图4
较少的兆比特3-缺乏PAX6+根尖祖细胞在E15.5和E16.5之间分化。（A）Ki67的E14.5和E16.5冠状脑切片的代表性免疫染色。白线表示VZ和VZ外部（非VZ）之间的假定边界。（B）量化每100μm皮质长度VZ中Ki67+细胞的数量。N个 = 3至6*P（P） = 0.0199,数据流 = 2（C）BrdU（红色）和Ki67（绿色）的E14.5和E16.5冠状脑切片的代表性免疫染色。底部面板是上图中方框区域的放大图像。（D）量化每100μm皮质长度中Ki67阴性的VZ中BrdU+/Ki67−细胞的百分比（右侧面板）。N个 = 3至6*P（P） = 0.0015,数据流 = 2.误差条代表标准偏差比例尺=100μm。
图5
图5
PAX6+祖细胞退出细胞周期导致基底祖细胞和神经元数量减少。此图显示了WT（左）和Mbd3cKO（右）小鼠中三个具有代表性的PAX6+根尖祖细胞如何随着时间的推移做出细胞命运决定。在Mbd3cKO小鼠中，PAX6+细胞在没有最终分化为神经元的情况下退出细胞周期（最右侧），减少了EOMES+基础祖细胞和神经元的产生。起初，这种影响很小（E14.5），但随着时间的推移，其严重性会增加（E18.5）。请注意，在WT和Mbd3cKO中，心尖祖细胞的数量随着时间的推移而减少，正如预期的那样，但在每个时间点，这两个组的数量是可比较的。
图6
图6
神经元产生和皮层分层的改变兆比特3-大脑缺陷。E14.5冠状脑切片的代表性免疫染色（A），E16.5（C）和E18.5（E）用于TBR1（蓝色，第6层）、BCL11B（绿色，第5层）和SATB2（红色，第2-4层）。E14.5每100μm皮质长度染色细胞数量的量化（B），E16.5(天, *P（P） = 0.0040,数据流 = 2个[TBR1]；P（P） = 0.0220,数据流 = 2[BCL11b]；P（P） = 0.0010,数据流 = 2[SATB2]）和E18.5(F类, *P（P） = 0.0100,数据流 = 2[BCL11b]；P（P） = 0.0090,数据流 = 2[BRN2]）。比例尺=100μm；N个 = 3到6。错误栏表示中的st.dev.白色箭头（B）和（C）指出WT脑中BCL11B高表达和低表达细胞，而在cKO脑中，只有BCL11B高表达细胞存在。红色、绿色和蓝色条（C）和（E），WT合并图像显示基于染色的不同皮层神经元层。这些层在Mbd3 cKO大脑中没有出现或减少（黄色条，（C）和（E）合并图像）。
图7
图7
在没有MBD3的情况下，皮质神经元规范不正确。在E13.5给怀孕小鼠注射一次BrdU，并在E18.5检查胚胎。（A）E18.5冠状脑切片对BrdU（红色）和上层神经元标记物BRN2（白色）的代表性免疫染色。（B）E18.5冠状脑切片对BrdU（红色）、TBR1（绿色）和SATB2（白色）的代表性免疫染色。（C）对TBR1阳性的皮质板BrdU+细胞百分比的量化(*P（P） = 0.0210,数据流 = 2） 或TBR1和SATB2均为正(*P（P） = 0.0016,数据流 = 2） 每100μm皮质长度。白线表示皮质板的假定下边界。比例尺=100μm；N个 = 3至6。误差条代表标准偏差。
图8
图8
STEM计划的总产出。STEM分析确定的重要集群。对于每个面板，野生型胚胎中的表达在左侧以蓝色显示，突变胚胎中的表现在右侧以红色显示。发育时间（E12.5、E14.5和E16.5）绘制在x个-轴和表达式级别年-轴以任意单位表示。对于每个簇，数据沿x个-轴为WT12.5、WT14.5和WT16.5（蓝色）以及cKO12.5、cKO14.5和cKO16.5（红色）。
图9
图9
MBD3/NuRD在哺乳动物神经发生过程中调节基因表达模式。（A）对野生型（左）和Mbd3 cKO（右）样本分别绘制簇35和簇39中发现的基因表达。（B）在E12.5、E14.5和E16.5，WT和突变祖细胞中指示基因的相对表达。在所有情况下，表达式值都是相对于E12.5处的WT表达式绘制的。N个 = 3到4。对于野生型与E14.5处的突变样本北hlh2*P（P） = 0.0066，数据流 = 2.对于野生型与E16.5处的突变样品*P（P） = 0.0032,数据流 = 2 (Nhlh1号机组);P（P） = 0.0002,数据流 = 2 (神经D1);P（P） = 0.0403,数据流 = 2 (北hlh2);P（P） = 0.0001,数据流 = 2个(神经D2).（C）在E14.5和E16.5的野生型（WT）和条件敲除（KO）皮层中，使用抗Mbd3抗体或兔IgG对照进行染色质免疫沉淀（ChIP）。用位于指定基因上的引物对（如表3所示）探测免疫沉淀物，并绘制输入百分比(年-轴线；错误条表示st.dev.）。跨x个-轴表示所示基因相对于转录起始位点的距离。基因结构如下图所示：白色方框表示非编码区域，蓝色方框表示编码区域，绿色方框表示根据UCSC基因组浏览器mm9上的组蛋白ChIP数据推测的增强子区域。（D）对野生型（左）和cKO（右）样本分别绘制簇28和簇29中发现的基因表达。（E）E16.5野生型和突变型脑样本中指示基因的相对表达。N个 = 3; *P（P） = 0.0004 (神经D4),P（P） = 0.0026 (S100β),P（P） = 0.0001 (Gfap公司),数据流 = 2; 误差条表示st.dev。（F）S100β（红色）E18.5冠状脑切片的代表性免疫染色。白色箭头表示Mbd3 cKO样品中一个罕见的阳性染色细胞比例尺=200倍放大100μm，630倍放大50μm。
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