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.2015年4月18日12时32分。
doi:10.1186/s12950-015-0077-0。 电子收集2015。

TLR2和AP-1/NF-kappaB参与热杀性单核细胞增生李斯特菌诱导人单核细胞THP-1细胞MMP-9的调节

Puthiyaveetil Kochumon Shihab村 1, 区域Al-Roub 1, 莫内拉·阿尔·甘尼姆（Moneera Al-Ghanim） 1, 安法尔Al-Mass 1, 卡齐姆·贝贝哈尼 1, 拉希德·艾哈迈德 1
附属公司

TLR2和AP-1/NF-kappaB参与热杀性单核细胞增生李斯特菌诱导人单核细胞THP-1细胞MMP-9的调节

Puthiyaveetil Kochumon Shihab村等。 燃烧杂志（伦敦）. .

摘要

背景：MMP-9对正常免疫反应至关重要，但这种酶的过度释放会导致严重的组织损伤。单核细胞增生性李斯特菌（LM）是一种机会性食源性病原体，可引起李氏杆菌病、脑膜炎和败血症。热杀李斯特菌（HKLM）激活免疫系统并导致细胞因子和趋化因子的产生。然而，关于HKLM参与MMP-9调控的情况尚不清楚。因此，我们研究了HKLM在调节THP-1细胞MMP-9基因表达中的作用。

方法：本研究中使用了市售热杀单核细胞增生李斯特菌。用实时定量qPCR和ELISA评估HKLM诱导的MMP-9表达。通过使用THP-1-XBlue™细胞（THP-1-cells with NF-κB/AP-1 reporter construction）、THP-1-XLue™-defMyD细胞（MyD88（-/-）THP-1细胞）、抗TLR2单克隆抗体和药物抑制剂，研究了HKLM在不同信号通路中的作用。蛋白质印迹法测定磷和总蛋白。

结果：与未经刺激的THP-1细胞相比，在HKLM刺激的THP1细胞中观察到MMP-9生成增加（mRNA：395倍；蛋白质：8141 pg/ml；P<0.05）。MMP-9的产生被抗TLR2阻断单克隆抗体完全阻断（P=0.0024）。此外，THP-1-XBlue™-defMyD细胞不能产生MMP-9来应对HKLM。在THP-1-XBlue™细胞中也观察到HKLM诱导的NF-kappaB/AP-1活化。此外，JNK（SP600125）、MEK/ERK（U0126；PD98056）、p38 MAPK（SB203580）和NF-kappaB（BAY 11-7085、雷公藤内酯醇和白藜芦醇）抑制剂显著抑制（P<0.05）HKLM刺激的MMP-9表达。

结论：我们的结果表明，HKLM激活TLR2和NF-κB/AP-1信号通路，导致THP-1细胞MMP-9的生成上调。因此，MMP-9可能是阻止感染或慢性炎症引起的严重组织损伤的合适治疗靶点。

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数字

图1
图1
HKLM上调THP-1细胞中MMP-9的表达。用不同浓度的HKLM（1-9x10）刺激THP-1细胞7颗粒/ml）。收集细胞和培养上清液。提取细胞总RNA，实时PCR定量MMP-9 mRNA。相对mRNA表达为载体处理细胞中基因表达平均值的倍数。车辆处理细胞中的平均基因表达水平假定为1（A）.通过ELISA测定上清液中分泌的MMP-9水平（B）用HKLM（3x10）刺激THP-1细胞7/ml）、TNF-αlph（25 ng/ml；阳性对照）和溶媒（H2O；2ul/ml）24小时。收集细胞和培养上清液。通过实时PCR定量MMP-9 mRNA（D）ELISA检测上清液中TIMP-1和MMP-9的分泌水平（C&E）如材料和方法中所述，在上清液中测定SEAP报告活性（NF-κB/AP-1活化程度）（F）给出了三个独立实验的结果。数据以平均值±SE表示。星号（*）表示P（P）-值<0.05。
图2
图2
TLR-2中和抗体对HKLM诱导MMP-9表达的影响。在添加HKLM之前，对THP-1细胞进行30分钟的抗huTLR-2-IgA（中和单抗；Nab；2ug/ml）或等型匹配对照抗体（IgA）处理。在HKLM处理后24小时收集细胞和细胞培养上清液。通过实时PCR定量MMP-9 mRNA（A）ELISA法检测上清液中MMP-9的分泌水平（B）根据材料方法所述，在上清液中测定SEAP报告活性（AP-1/NF-κB活化程度）（C）数据来自三个独立的实验。数据以平均值±SE表示。星号（*）表示P（P）-值<0.05。
图3
图3
MyD88缺乏对HKLM诱导MMP-9的影响。用HKLM（3x10）处理THP-1-XBlue™-defMyD细胞（缺乏MyD88活性的细胞）7/ml）、TNF-α（25 ng/ml）和溶媒（水；2ul）24小时。收集细胞和上清液。细胞用于总RNA的分离，MMP-9基因表达通过实时PCR定量（A）.用ELISA法测定上清液中MMP-9蛋白的分泌水平（B）细胞上清液中也测定了SEAP报告活性（AP-1/NF-κB活化程度）（C）数据显示为平均值±SE。星号（*）表示P（P）-值<0.05。
图4
图4
HKLM激活MAP激酶信号通路。用HKLM处理THP-1细胞不同时间点，并按方法制备细胞裂解物。样品在变性凝胶上运行。磷酸化MEK1/2、ERK1/2、JNK、p-38和c-Jun显示在上部面板中，相应的总蛋白显示在下部面板中。如图所示，HKLM处理以时间依赖的方式增加MEK1/2、ERK1/2、JNK、p38和c-Jun的磷酸化（A）THP-1细胞用MEK-ERK抑制剂预处理（U0126:10μM，2小时）；PD98059:10μM持续1小时）或JNK抑制剂（SP600125:20μM持续30分钟）或p38抑制剂（SB203580:10μM保持1小时），然后用HKLM（3x107/ml）24小时。收集细胞和上清液。细胞用于分离总RNA，并通过实时RT-PCR评估MMP-9 mRNA（B）.用ELISA法测定上清液中MMP-9蛋白的分泌水平（C）显示了从三个独立实验中获得的结果。数据以平均值±SE表示。星号（*）表示P（P）-值<0.05。
图5
图5
NF-kappaB途径抑制剂对MMP-9诱导的影响。用FSL-1处理THP-1细胞不同时间点，并按方法制备细胞裂解物。样品在变性凝胶上运行。磷酸化的IKKα/β、IkB和NF-κB显示在上部面板中，B-actin显示在底部面板中（A）用NF-κB抑制剂（BAY 11–7085，10μM；雷公藤内酯醇，10μM或白藜芦醇，15μM）预处理THP-1细胞1小时，然后用HKLM（3x107/ml）24小时。收集细胞和上清液。细胞用于总RNA的分离，MMP-9 mRNA通过实时PCR进行评估（B）.用ELISA法测定上清液中MMP-9蛋白的分泌水平（C）数据显示为平均值±SE。星号（*）表示P（P）-值<0.05。
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