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.2015年4月23日；520(7548):563-6.
doi:10.1038/nature14147。 Epub 2015年2月9日。

ATG14促进自噬体与内溶酶体的膜连接和融合

嘉杰刁 1, 刘荣（音） 2, 岳光荣 三, 赵明磊 1, 张静（音译） 三, 英莱 1, 周强军 1, 利维亚·M·威尔兹 4, 李建旭 4, 桑德罗·维沃纳 1, 理查德·普费茨纳 1, Axel T Brunger公司 1, 清忠 三
附属公司

ATG14促进自噬体与内溶酶体的膜栓系和融合

嘉杰刁等。 自然. .

摘要

自噬是一种重要的分解代谢途径，与多种人类疾病有关，它始于形成吞噬胞质货物的双膜自噬体，最终通过将自噬体与溶酶体融合进行降解。膜融合活性是自噬体早期生物发生和溶酶体晚期降解所必需的。然而，自噬膜栓系和融合的关键调控机制仍不清楚。在此，我们报告了ATG14（也称为beclin-1-associated autophage-related key regulator（Barkor）或ATG14L），它是III类磷脂酰肌醇3-激酶复合物的一种重要的自噬特异性调节物，促进无蛋白脂质体的膜栓系，并增强用靶（t）-SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）syntaxin 17（STX17）和SNAP29以及囊泡（v）-SNARE VAMP8（囊泡相关膜蛋白8）重建的蛋白质脂质体的半融合和完全融合。ATG14通过其线圈结构域与STX17的SNARE核心结构域结合，并在自噬体上稳定STX17-SNAP29二元t-SNARE复合物。ATG14的STX17结合、膜系留和融合增强活性需要通过半胱氨酸重复序列进行同源低聚化。在ATG14同源寡聚缺陷细胞中，自噬体仍能有效形成，但与内溶酶体的融合受阻。重组ATG14同源异构化突变体也完全失去了促进膜栓系和增强SNARE介导的体外融合的能力。综上所述，我们的数据表明了一种自噬特异性膜融合机制，其中低聚物ATG14直接与自噬体上的STX17-SNAP29二元t-SNARE复合物结合，并使其与VAMP8相互作用，以促进自噬体内融合。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。ATG14、STX17和beclin 1之间的相互作用
一重组表达和纯化全长标记STX17、SNAP29和VAMP8的考马斯染色SDS凝胶。b在联合免疫沉淀分析中，Myc-ATG14的过度表达稳定了STX17–SNAP29二元t-SNARE复合物。c（c）在联合免疫沉淀分析中，ATG14与STX17的SNARE核心结构域相互作用。d日在联合免疫沉淀分析中，ATG14的CCD结构域与STX17相互作用。e（电子）采用Superdex 200对beclin 1、ATG14、STX17进行分级，并进行或不进行氯喹处理。（f），STX17与beclin 1无关。在HEK293T细胞中，将标记的STX17与Myc-ATG14或Myc-beclin 1联合转染。ATG14而非beclin 1与STX17共同免疫沉淀。免疫沉淀效率（免疫沉淀/输入）通过免疫沉淀ATG14或beclin 1与其输入的比率进行标准化。克，STX17与ATG14在一种不同于beclin 1/PI3KC3复合物的复合物中相互作用。来自U的细胞裂解物2用抗Flag M2珠免疫沉淀稳定表达Flag–beclin 1或ATG14的OS细胞，在免疫沉淀中检测到内源性beclin 1、ATG14和STX17。
扩展数据图2
扩展数据图2。氯喹或巴非霉素A1处理后ATG14和STX17在自噬体上的共定域
一,b，GFP–ATG14与STX17–Flag在氯喹-(一)或巴菲菌素-A1处理(b)U型2OS细胞，并用GFP荧光和抗Flag抗体进行免疫染色检测。免疫染色中，通过抗LC3、LAMP2或Atg16抗体检测到内源性LC3、LAMP1或Atg15(n个=20). 比例尺，5μm。
扩展数据图3
扩展数据图3。ATG14介导的膜栓系特性
一，单囊泡/脂质体醚化试验方案,DiD标记脂质体通过生物素/中性抗生物素的相互作用附着在成像表面；通过红色激光激发（633nm）来评估表面结合。用绿色激光激发（532 nm）检测栓接的DiI标记脂质体。该分析用于图2a和4e以及扩展数据图3c–h、5d和5g。b，基于FRET的单囊泡/脂质体脂质混合分析方案。用绿色激光（532 nm）照射，激发固定的DiI标记脂质体。使用二向色分束器同时检测绿色和红色光谱区域的发射。在绿色荧光通道中计数栓接DiI标记脂质体的总数，在红色荧光通道中观察到与DiD受体染料的FRET。该分析仅用于图2b。视野为45μm×90μm。有关详细信息，请参见方法。c（c），ATG14（900 nM）的BATS域缺失突变体不促进脂质体栓系。顶部面板：定量。底部面板：栓系脂质体的代表性荧光图像(n个=15).d日，BATS结构域单独不能促进脂质体束缚。上图：定量。底部面板：栓系脂质体的代表性荧光图像(n个=15).e（电子），纯化的重组ADP-核糖基化因子GTPase激活蛋白1（ARFGAP1，870 nM）不促进脂质体栓系。顶部面板：定量。底部面板：栓系脂质体的代表性荧光图像(n个=15).（f），纯化的重组内啡肽1/Bif 1（2μM）不促进脂质体栓系。顶部面板：定量。底部面板：栓系脂质体的代表性荧光图像(n个=15).克，将2%的PI3P掺入直径为50nm的小脂质体中，未能增强ATG14对脂质体的醚化活性。上图：定量。底部面板：栓系脂质体的代表性荧光图像(n个=15).小时，将2%的PI3P掺入大的脂质体（直径为400nm）中可增强ATG14的脂质体醚化活性。顶部面板：量化。底部面板：栓系脂质体的代表性荧光图像(n个=15). 中的结果c（c）–小时表示为随机成像位置的平均值（±s.d.）(n个=15）在同一采样通道中。
扩展数据图4
扩展数据图4。自噬SNARE复合体的结构
一，VAMP8、STX17和SNAP29中SNARE域的边界。b自噬SNARE复合体的纯化。克隆了VAMP8、STX17和SNAP29的四个SNARE核心结构域（带有两个SNARE核心结构域），并在大肠杆菌和共同纯化（见方法）。四个片段形成一个复合物，SEC显示为一个单峰。所示四个洗脱馏分的SDS-PAGE凝胶显示出与四个SNARE核心结构域相对应的个别条带。请注意，VAMP8（10–74）、STX17（164–277）和SNAP29（194–258）的迁移位置大致相同。最左边的通道是一个标记了分子量的蛋白质阶梯。c（c），SNARE结构的比较。图示为自噬、神经元、酵母、早期内体和内体SNARE复合体结构在两个不同方向上的卡通表示和表面电荷分布。结构的放置使得SNARE复合物的羧基末端朝向右侧。使用PyMOL中的默认“真空静电”生成表面电荷分布以进行定性
扩展数据图5
扩展数据图5。测定ATG14对自噬SNAREs介导的膜融合的特异性并表征重组ATG14同源异构化
一，使用自噬SNARE重组蛋白脂质体（v-和t-蛋白脂质体）进行整体含量测定的方案。b纯化的重组Flag–STX17、His-VAMP2、His-SNAP25和His-Syntaxin1与与重组ZZ–Flag-ATG14相关联的IgG Sepharose孵育，ATG14结合蛋白用TEV蛋白酶裂解并用考马斯蓝染色检测（上图）。ZZ–Flag–ATG14与IgG Sepahrose结合，通过底部面板的western blotting检测到。ATG14与STX17结合，但不与神经元SNARE结合。c（c），ATG14对用神经元SNARE重建的蛋白质脂质体的整体脂质合成没有明显的促进作用(n个=3).d日，ATG14 CCD缺失突变体的膜系留活性基本上完好无损。所示为栓系囊泡的平均数量（±s.d.）(n个=15）在同一采样通道中。e（电子），ATG14 CCD缺失突变未能增强用自噬SNARE重建的蛋白质脂质体的整体脂质混合(n个=3).（f），通过SEC–MALS测定重组ATG14的寡聚状态。克，通过单个无蛋白囊泡/脂质体膜系留分析测定ATG14单体和二聚体的膜系留活性。所示为栓系小泡的平均数量（±s.d.）(n个=15）在同一采样通道中。底部面板中显示了代表性图像(n个=15).小时，将ATG14齐聚位点映射到其N末端。将标记的全长ATG14或ATG14截短突变体（缺少前70个残基）转染到HEK293T细胞中，并用交联剂DSS（0，0.1，0.2，0.4 mM）处理30分钟，然后进行SDS-PAGE分析。用抗Flag抗体检测ATG14。我，ATG14CCD缺失突变体在DSS交联测定中仍然形成低聚物。j个纯化的重组ATG14（36 nM）在含有12.5 mM TCEP（第2道）、25 mM DTT（第3道）或2.5%β-巯基乙醇（第4道）或模拟处理（第1道）的非还原性SDS样品缓冲液中煮沸，将样品装载在非还原性的SDS-PAGE上，并探测ATG14的抗Flag抗体。k个将Flag–ATG14转染到HEK293T细胞中，并用雷帕霉素（500 nM，12 h）和/或交联剂DSS（0.2μM）处理30 min，然后进行SDS–PAGE分析。用抗Flag抗体检测ATG14。
扩展数据图6
扩展数据图6。ATG14均聚化对beclin 1相互作用和PI3KC3活化不是必需的
一，在联合免疫沉淀试验中观察到标记的WT ATG14和带有HA标记的beclin 1的突变体之间的相互作用。b，从昆虫细胞中纯化标记的PI3KC3复合亚基。c（c），显示p150而非beclin 1刺激Vps34脂激酶活性的图表，使用在体外TLC激酶测定。所示为放射性PI3P斑点的平均强度值（±s.d.）(n个=3). AU，任意单位。d日，ATG14增强Vps34–p150–beclin 1的脂激酶活性。所示为放射性PI3P斑点的平均强度值（±s.d.）(n个=3).e（电子）beclin 1和p150对ATG14促进作用的要求。所示为放射性PI3P斑点的平均强度值（±s.d.）(n个=3).（f），从昆虫细胞中纯化ATG14野生型和突变体。每个重组蛋白加载两个剂量。克，ATG14 WT和突变体对Vps34（V）–p150（P）–beclin 1（B）脂激酶活性的影响。所示为放射性PI3P斑点的平均强度值（±s.d.）(n个=3).
扩展数据图7
扩展数据图7
ATG14同源低聚化缺陷突变体的自噬体靶向性。GFP、GFP–ATG14 WT、GFP-ATG14 C43/46A、GFP-ATG14 C55/58A和GFP-ATG14 4C4A与STX17-Flag在U2OS细胞和免疫染色检测。免疫染色中用抗LC3抗体检测内源性LC3(n个=20). 比例尺，5μm。
扩展数据图8
扩展数据图8。ATG14 HOD突变体的亚细胞定位特征
一，U2转染GFP–ATG14 WT或ATG14 4C4A和mCherry-Sec61β（ER标记）的OS细胞经EBSS处理2 h，并与内源性Tom20（线粒体标记）共同染色。在ER（Sec61β）和线粒体（Tom20）的交界处发现了GFP–ATG14和GFP–ATG14 4C4A(n个=20). 比例尺，5μm。bATG14 4C4A突变体中内源性LC3和GFP–STX17的积累，但在ATG14 WT或敲除（KD）细胞中没有mCherry-Atg16的积累(n个=20). 比例尺，5μm。c（c），ATG14击倒U2稳定补充ATG14 WT或4C4A突变体ATG14的OS细胞转染GFP–ATG16，并进行内源性LC3染色和ATG16荧光成像。ATG14 4C4A细胞中积聚LC3而非ATG16点状细胞(n个=20). 比例尺，5μm。d日，ATG14击倒U2用GFP–STX17转染稳定补充ATG14 WT或4C4A突变体ATG14的OS细胞，并对内源性ATG16染色和STX17荧光进行成像。在ATG14 4C4A细胞中积聚STX17而非ATG16点(n个=20). 比例尺，5μm。
扩展数据图9
扩展数据图9。ATG14同源异构化是自噬体成熟所必需的
一mRFP–GFP–LC3与WT或突变ATG14在U中表达2对OS细胞和ATG14表达细胞中的LC3点（重叠的绿色和红色荧光）进行成像(n个=20). 比例尺，5μm。黄色LC3信号表示融合前的吞噬细胞或自噬体。红色的LC3信号代表酸化的成熟自噬体。未经治疗。雷帕霉素。相应的定量统计分析如图4c所示。b，ATG14敲除U中Flag–ATG14或Flag-ATG14 4C4A的稳定表达2OS细胞。c（c），U中的蛋白酶保护试验2用氯喹处理OS ATG14 WT细胞（2小时）。U型2用表达GFP–LC3的慢病毒感染OS ATG14 WT细胞24小时，并在收获前2小时用氯喹处理。通过离心分离这些细胞中富含自噬体的部分，并用胰蛋白酶（10μg ml）培养−1)在30°C下，使用或不使用0.4%Triton X-100，持续25分钟。western blotting检测GFP或GFP–LC3。
图1
图1。ATG14在成熟自噬体上与STX17–SNAP29相互作用
一，使用在体外GST下拉试验，然后进行western blot（IB，免疫印迹）。b，重组ATG14使用在体外免疫球蛋白-G（IgG）下拉试验，然后进行western blot。c（c）通过免疫染色检测EBSS标记U中的Flag–STX17、GFP–ATG14、内源性LC3、LAMP2和ATG162OS细胞(n个=20). 比例尺，5μm。d日，EBSS或氯喹（CQ）治疗后ATG14、STX17和LC3共定位的相应统计分析。
图2
图2。ATG14促进膜栓系并增强自噬SNARE介导的融合
一纯化的重组ATG14促进无蛋白单脂质体栓系（方法和扩展数据图3a）。顶部：栓系脂质体的平均数量（±s.d.）(n个=15）在样品室中的任意位置；底部：对应的代表图像(n个=15).b，添加重组ATG14后，单个供体/受体-双色脂质体对之间的荧光共振能量转移（FRET）效率曲线（方法和扩展数据图3b）。c（c），自噬SNARE复合体的晶体结构显示在底部，中心离子层的特写视图显示在顶部。d日，ATG14增强自噬SNARE重组蛋白脂质体的整体脂质体合成(n个=3).e（电子），ATG14增强用自噬SNARE重建的蛋白质脂质体的整体含量混合(n个=3); a.u.，任意单位。（f），典型的低温电子显微照片(n个=20）用自噬SNARE重建的蛋白脂质体。左：不带ATG14。中间：带ATG14；黑色和白色箭头分别表示半融合隔膜和蛋白质脂质体簇。右：近景；黑色和红色箭头分别表示半融合隔膜和栓系蛋白脂质体对。比例尺，200 nm。克、半融合或聚集蛋白质脂质体显微照片的百分比(n个=20).
图3
图3。自噬SNARE结合需要ATG14同源异构化
一，转染到HEK293T细胞中的ATG14-Flag对ATG14-eGFP的免疫沉淀（IP）。b，通过与DSS交联，将ATG14齐聚位点映射到其半胱氨酸重复序列，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。c（c）联合免疫沉淀试验中观察到标记野生型（WT）ATG14与Myc-ATG14突变体之间的相互作用。IP效率。，免疫沉淀效率。d日，在联合免疫沉淀试验中观察到标记WT ATG14和突变体与内源性STX17之间的相互作用。免疫沉淀效率（免疫沉淀/输入）c（c）和d日通过免疫沉淀Flag–ATG14或相互作用物与其输入物的比率进行标准化。e（电子）,体外GST标记自噬SNAREs纯化重组WT ATG14或C43A/C46A突变体的GST下拉，然后进行western blot。
图4
图4。ATG14同源异构化是自噬体与内溶酶体融合所必需的体内和在体外
一、ATG14缺乏U的自噬通量分析2用WT ATG14和突变体重组OS细胞。未经处理；Tor-1，Torin 1。bTEM下ATG14 4C4A突变体中完整的双膜自噬体（红色箭头）的积累，但在雷帕霉素处理的ATG14 WT或敲除（KD）细胞中没有(n个=15). 白色箭头表示自溶体。c（c）、酸化自噬体（GFP）的定量分析−射频功率+)与中性自噬体（GFP+射频功率+)雷帕霉素处理的ATG14敲除U中的每个细胞2表达WT或突变型ATG14的OS细胞转染mRFP–GFP–LC3（平均值±标准差）(n个=20).d日，GFP–LC3在ATG14 4C4A突变体中受胰蛋白酶消化保护，但在ATG14WT或敲除细胞中没有。e（电子），通过重组野生型ATG14和特定突变体使用单囊泡膜系留分析系留无蛋白脂质体（系留脂质体的平均数量±s.d.）(n个=20)).（f）自噬SNARE重组蛋白脂质体之间WT ATG14和突变体的脂质合成活性(n个=3).
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