Ubiquitination and proteasomal degradation of ATG12 regulates its proapoptotic activity

doi:10.4161/15548627.2014.981914

.2014;10(12):2269-78.

doi:10.4161/15548627.2014.981914。

ATG12的泛素化和蛋白酶体降解调节其促凋亡活性

玛蒂娜·哈勒¹, 安德烈亚斯·科克, 埃文格洛斯·贾姆帕佐利亚斯, 安德鲁·奥伯斯特, 道格拉斯·R·格林, 贾扬塔·德伯纳, 凯文·M·瑞安, 凯伦·沃斯登, 斯蒂芬·W·G·泰特

附属公司

PMID： 25629932
PMCID公司：项目经理4502749
内政部： 10.4161/15548627.2014.981914

ATG12的泛素化和蛋白酶体降解调节其促凋亡活性

玛蒂娜·哈勒等。自噬. 2014.

.2014;10(12):2269-78.

doi:10.4161/15548627.2014.981914。

作者

玛蒂娜·哈勒¹, 安德烈亚斯·科克, 埃文格洛斯·贾姆帕佐利亚斯, 安德鲁·奥伯斯特, 道格拉斯·R·格林, 贾扬塔·德伯纳, 凯文·M·瑞恩, 凯伦·沃斯登, 斯蒂芬·W·G·泰特

附属

¹英国比森癌症研究所；英国格拉斯哥。

PMID： 25629932
PMCID公司：第502749页
内政部： 10.4161/15548627.2014.981914

摘要

在大分子自噬过程中，ATG12与ATG5的结合对于LC3脂质化和自噬体的形成至关重要。此外，ATG12在线粒体融合和线粒体依赖性凋亡等多种过程中具有ATG5非依赖性功能。在本研究中，我们研究了游离ATG12的调节。与稳定的ATG12-ATG5共轭物形成鲜明对比的是，我们发现游离的ATG12高度不稳定，并以蛋白酶体依赖的方式快速降解。令人惊讶的是，ATG12本身是一种泛素样蛋白，直接被泛素化，从而促进其蛋白酶体降解。作为其转换的功能结果，游离ATG12的积累有助于蛋白酶体抑制剂介导的凋亡，鉴于蛋白酶体抑制剂被用作抗癌药物，这一发现可能具有重要的临床意义。总的来说，我们的结果揭示了自噬、蛋白酶体活性和由ATG12的泛素样性质介导的细胞死亡之间的新联系。

关键词：ATG，自噬相关；ATG12；行动D，放线菌素D；BCL2L1，BCL2类1；BH3、BCL2同源结构域3；CHX，环己酰亚胺；HBSS，Hank的平衡盐溶液；LC3/MAP1LC3，微管相关蛋白1轻链3；MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；RNA干扰；UB，泛素；UBL，泛素样蛋白；细胞凋亡；蛋白酶体降解；泛素样蛋白；无处不在。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
游离ATG12以蛋白酶体依赖的方式快速降解(A类)U2OS细胞中ATG12的Western blot检测。(B类)CHX治疗后U2OS细胞内源性ATG12表达。(C类)将表达空载体或ATG12的U2OS用CHX处理不同时间，并检测ATG12表达。(D类)按照MG132和/或CHX的指示，处理U2OS细胞8小时，并检测ATG12的表达。(电子)U2OS用MG132或lactacystin治疗8小时，并检测ATG12的表达。(F类)如图所示，用MG132和/或CHX处理表达ATG12的U2OS 8小时，并检测细胞裂解液中的ATG12表达。ACT或TOMM20用作加载控制。

**图2。**
游离ATG12蛋白的蛋白酶体降解与自噬无关(A类)E1A和*Ras公司*-转换WT或*附件7*用MG132处理敲除MEF 8h，并检测细胞裂解液中ATG12的表达。(B类)*附件3*或(C类)*Atg5型*用MG132处理敲除MEF 4h和8h，并分析ATG12的表达。(D类)表达ATG12的U2OS细胞^G140A型用MG132和/或CHX处理8小时，并检测裂解物的ATG12表达。在所有免疫印迹中，ACT被用作负荷控制。

**图3。**
游离ATG12的直接泛素化调节其蛋白酶体降解(A类)如图所示，用MG132处理表达载体或ATG12和His-ubiquitin的293T细胞。对细胞裂解物进行His-tag亲和分离，并对ATG12和泛素表达进行免疫印迹(B类)*附件12*敲除的MEFs，以及稳定表达的MEFs附件12，用氯喹处理4h，然后检测ATG12和LC3B的表达。(C类)将表达ATG12或ATG12[K-]的293T细胞与His-ubiquitin一起按指示处理，进行His-tag亲和分离，并检测ATG12和泛素的表达。(D类)表达ATG12或ATG12[K-]的U2OS细胞，用CHX处理6小时，并分析ATG12和TOMM20的表达，使用ImageJ软件进行密度分析，归一化为TOMM20水平。(电子)按照指示用MG132和/或CHX处理表达ATG12[K-]的U2OS细胞8小时，并检查ATG12的表达。ACT或TOMM20用作负荷控制。

**图4。**
游离ATG12促进蛋白酶体抑制剂介导的细胞死亡(A类)用MG132处理稳定表达空载体或BCL2L1的U2OS细胞，并用孵育细胞成像仪通过SYTOX-Green染色测定细胞活力；数据表示代表性时间点（24小时）3个实验平均值（SEM）的平均+/-标准误差。(B类)U2OS细胞转染后第2天用对照或*ATG12型*小干扰RNA。对照组或*ATG12型*用MG132处理siRNA-转染的U2OS细胞(C类)哈佛商学院(D类)或行动D(电子)使用孵育细胞成像仪通过SYTOX绿色染色确定；所示的代表性时间点（24小时MG132、30小时HBSS、24小时Act D）。图表示4个实验的平均+/-SEM。(F类)U2OS，转染对照或*ATG12型*siRNA或稳定表达载体或BCL2L1在HBSS中缺乏。饥饿48小时后，洗涤细胞，在DMEM中培养7天，并用亚甲基蓝染色菌落。(**G公司**)用HBSS（24 h）、MG132（16 h）或Act D（16 h。在所有免疫印迹中，ACT被用作负荷控制。

**图5。**
游离ATG12促进独立于自噬的细胞死亡(A类)稳定表达载体草莓或草莓-ATG4B的U2OS细胞^C74A号用氯喹处理4h，并对细胞裂解液进行RFP和LC3B的印迹。稳定表达载体草莓或草莓-ATG4B的U2OS细胞^C74A号用对照或*ATG12型*小干扰RNA。(B类)MG132治疗后（24小时）或(C类)HBSS饥饿（48小时），细胞活力通过孵化成像仪中的SYTOX绿色排斥测定。图表显示了3的平均+/-SEM(B类)或5(C类)在代表性时间点进行实验（24h MG132，48 h HBSS）。Western blot显示稳定表达载体草莓或草莓-ATG4BC74A的U2OS细胞的细胞裂解物，转染对照或*ATG12型*siRNA，用MG132处理8小时(B类)或HBSS(C类)并探测RFP、LC3B和ATG12。在所有免疫印迹中，ACT或TOMM20被用作负荷对照。

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