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随机对照试验
。2015年2月；125(2):687-98.
doi:10.11172/JCI72873。 Epub 2015年1月20日。

丙酮酸羧化酶对非小细胞肺癌的增殖至关重要

凯瑟琳·塞勒斯, 马修·福克斯, 迈克尔·布萨姆拉第二, 史蒂芬·P·斯隆, 理查德·东芝（Richard M Higashi）, 唐纳德·米勒, 王雅丽, Jun Yan先生, 玛丽亚·奥尤涅娃, 拉胡尔·德什潘德, 安德鲁·莱恩, 特蕾莎W-M风扇
随机对照试验

丙酮酸羧化酶对非小细胞肺癌的增殖至关重要

凯瑟琳·塞勒斯等人。 临床研究杂志。 2015年2月。

摘要

合成代谢生物合成需要Krebs循环提供的前体，而Krebs周期又需要合成补体来补充前体中间产物。主要的再补来源是丙酮酸和谷氨酰胺，它们分别需要丙酮酸羧化酶（PC）和谷氨酰胺酶1（GLS1）的活性。由于其快速增殖，癌细胞增加了合成代谢和能量需求；然而，不同类型的癌细胞对PC和GLS介导的修复和细胞增殖途径有不同的要求。在这里，我们在组织切除前向早期非小细胞肺癌（NSCLC）患者注入均匀的13C-标记葡萄糖，并确定这些患者的癌组织中的PC活性增强。用13C6-葡萄糖或13C5,15N2-谷氨酰胺示踪剂培养的新鲜切除的成对肺组织切片证实了非小细胞肺癌中PC对GLS的选择性激活。与非癌组织相比，癌组织中PC的表达显著增强，而GLS1的表达无趋势。此外，配对肺组织的免疫组织化学分析显示，PC在癌细胞中过度表达，而不是在肿瘤组织的基质细胞中。在小鼠异种移植模型中，PC敲除诱导多核化，降低人类NSCLC细胞的细胞增殖和集落形成，并降低肿瘤生长。生长抑制伴随着克雷布斯循环活动的扰动、脂质和核苷酸生物合成的抑制以及谷胱甘肽稳态的改变。这些发现表明，PC-介导的早期非小细胞肺癌的修复是肿瘤生存和增殖所必需的。

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数字

图6
图6。PC抑制阻碍了Krebs循环驱动的生物合成。
(A类)13C原子分解嘧啶生物合成13C类6-葡萄糖和13C类5-谷氨酰胺用一个13C类5-通过磷酸戊糖途径（PPP）产生的核糖部分（红点）和13C类1-3尿嘧啶环（蓝点）来源于13C类2-4-通过克雷布斯循环或ME和PC的联合作用产生的天冬氨酸（蓝色圆点）。用shPC55或shEV转导的A549细胞与13C类6-葡萄糖或13C类5-谷氨酰胺24小时。从极性细胞提取物的FT-ICR-MS分析中分批富集UTP和CTP同位素表明13C类6-葡萄糖衍生13C类5-核糖（5同位素）和13C类6-葡萄糖–或13C类5-谷氨酰胺衍生13C类1-3-嘧啶环（“6–8”或“1–3”同位素，用绿色虚线矩形突出显示；对于“6-8”同位素，513Cs来自核糖和1-313C来自环）（10，45）。这些数据表明，PC敲除抑制葡萄糖和谷氨酰胺从头合成嘧啶。(B类)葡萄糖和谷氨酰胺碳通过柠檬酸盐进入脂肪酸。对非极性细胞提取物标记脂质的FT-ICR-MS分析表明，PC敲除严重抑制了葡萄糖和谷氨酰胺碳并入磷脂酰胆碱脂质的脂肪酰链（偶数）和脂肪酰链加甘油主链（奇数>3）。然而13C类三-甘油骨架（“3”同位素）或其前体13C类三-α-甘油-3-磷酸（αG3P，m+3）来自13C类6-PC基因敲除增强而非抑制葡萄糖。这些数据表明，PC抑制特别阻碍A549细胞中脂肪酸的合成。数值表示三个样本的平均值(n个=3），标准误差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（学生）t吨检验，假设方差不相等。
图5
图5。PC敲除扰乱了通过Krebs循环的葡萄糖和谷氨酰胺流量。
13C同位素浓度通过GC-MS测定(n个= 3). 值表示三倍的平均值，带有标准误差*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）<0.0001（学生）t吨检验，假设方差不相等。实验重复3次。(A类)用shPC55转导A549细胞10天，然后用13C类6-葡萄糖24小时。正如预期的那样13通过PC和Krebs循环活性产生的Krebs周期代谢物的C同位素在PC-deficient细胞中耗尽（由原子分辨图中的蓝点和条形图中的蓝色圆圈跟踪；另请参见图2C）。此外，13C类6-通过PDH的葡萄糖代谢也受到干扰（用红色圆点表示）。(B类)用13C类5,15N个2-谷氨酰胺表明，通过GLS的回补输入并不能补偿PC活性的损失，因为GLS活性减弱，正如活性标记（用红点和圆圈表示）所推断的那样。苹果酸酶（ME）对谷氨酰胺衍生苹果酸的脱羧作用以及谷氨酰胺衍生丙酮酸通过PC或PDH重新进入Krebs循环（分别以蓝色和绿色显示）也有所减弱。紫色钻石表示15N；黑钻石表示14N。
图4
图4。通过shRNA抑制PC抑制体外和体内人类NSCLC细胞系的增殖和致瘤性。
用嘌呤霉素进行转导和筛选后1周开始进行增殖和克隆形成试验。转导后8天在NSG小鼠中进行A549异种移植*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001，以及****P（P）<0.00001（学生）t吨检验，假设方差不相等。误差条代表SEM(A类)用shPC55或shEV转导NSCLC细胞系。增殖测定(n个=6）在相对较长的潜伏期后，所有5个细胞系中的PC敲除均显示出显著的生长抑制。(B类)集落形成分析表明，PC敲除降低了A549和PC9细胞在软琼脂中形成集落的能力(n个= 3). (C类)shPC55转导A549细胞的肿瘤异种移植的生长速度比对照shEV肿瘤慢2倍(P（P）<0.001由未配对的韦尔奇版本t吨测试）。肿瘤大小计算为πab/4，其中a和b是x，y直径。每个点代表平均6只小鼠。实线是非线性回归拟合方程：尺寸=a+bt吨2，如方法中所述。(D类)小鼠异种移植中PC基因敲除的程度(n个=6）比细胞培养中的小，导致PC表达减弱（对照组的30%–60%）和生长抑制减少。此外，根据皮尔逊相关系数，切除肿瘤中PC的表达与个体生长率相关。
图3
图3。肺组织中PC的免疫组织化学定位。
用抗PC抗体对非小细胞肺癌患者的CA和NC组织进行染色。所示为1名患者的典型显微照片。原始放大倍数，×400（顶部面板）和×600（底部面板）。补充图3提供了其他患者数据。在CA组织中，活的癌细胞对PC染色强烈，而巨噬细胞染色较弱，其他基质细胞对PC没有染色。在邻近的NC组织中，巨噬细胞对PC染色较强，而肺细胞对蛋白质染色很弱。
图2
图2。与成对NC肺切片相比，体外CA肺组织切片通过糖酵解和Krebs循环（有或无PC输入）增强了葡萄糖氧化。
将13例人类非小细胞肺癌患者新鲜切除的CA和NC肺组织薄片与13C类6-方法中所述的24小时葡萄糖。通过GC-MS测定乳酸、柠檬酸、谷氨酸和天冬氨酸的富集百分比(A类)1H（H）{13C} HSQC NMR显示标记的乳酸、谷氨酸和天冬氨酸增加。此外，CA组织升高13腺嘌呤核苷酸（1′-AXP）核糖部分的C丰度表明组织是活的，核苷酸合成能力增强。(B类)CA组织切片(n个=13）通过糖酵解增加了葡萄糖代谢，这是基于13C类三-乳酸（“3”），通过Krebs循环13C类4–6-柠檬酸盐（“4-6”）和13C类3–5-谷氨酸（“3-5”）（参见13C命运追踪C类)*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按配对学生）t吨测试。误差条代表SEM(C类)原子解析图说明了PC、PDH和2圈Krebs循环活动如何产生13柠檬酸和谷氨酸的C同位素B类，其富集在CA组织切片中显著增强。
图1
图1。PC在人类非小细胞肺癌肿瘤中被激活。
(A类)PC和GLS1催化Krebs循环中的主要合成补体输入（蓝色），以支持生物合成的合成代谢需求（绿色）。还显示了13C来自13C类6-葡萄糖通过糖酵解并通过PC进入Krebs循环（红色）。(B类)人类NC肺（N）和NSCLC（C）组织中PC和GLS1蛋白表达水平的代表性Western blots。(C类)成对PC和GLS1表达(n个=86）归一化为α-微管蛋白并绘制为对数10CA/NC组织比率。对于PC，几乎所有的对数比率都是阳性的（86个中有82个），聚集在0.5–1的范围内（即，肿瘤组织中的表达通常是正常的3到10倍；Wilcoxon试验，P（P）< 0.0001). 相反，GLS1表达在阳性和阴性对数之间几乎均匀分布10CA组织和NC组织之间无统计学差异（Wilcoxon检验，P（P）= 0.213). 水平条表示中间值。(D类)与配对NC肺组织相比，CA组织中的体内PC活性增强(n个=34）从相同的人类患者中切除13C类6-肿瘤切除前2.5～3小时血糖。PC活性根据13C类三-柠檬酸盐（Cit+3），13C类5-Cit（Cit+5），13C类三-苹果酸（Mal+3），以及13C类三-GC-MS测定的天冬氨酸（Asp+3）*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按配对学生）t吨测试。误差条代表SEM。
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