WT1 recruits TET2 to regulate its target gene expression and suppress leukemia cell proliferation

doi:10.1016/j.molcel.2014.12.023

.2015年2月19日；57(4):662-673.

doi:10.1016/j.molcel.2014.12.023。 Epub 2015年1月15日。

WT1招募TET2调节其靶基因表达并抑制白血病细胞增殖

附属公司

¹基因工程国家重点实验室，基因与发展协同创新中心，生命科学学院，分子与细胞生物学实验室，生物医学科学研究所，上海医学院，复旦大学，上海200032，中国。
²基因工程国家重点实验室、生命科学学院遗传与发展协同创新中心、复旦大学上海医学院生物医学研究所分子与细胞生物学实验室，上海200032；美国北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系Lineberger综合癌症中心，地址：北卡罗来那州教堂山教堂山，邮编：27599。
^三美国北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系Lineberger综合癌症中心，地址：北卡罗来那州教堂山教堂山，邮编：27599。
⁴上海交通大学医学院瑞金医院上海血液研究所，上海200025。
⁵基因工程国家重点实验室，基因与发展协同创新中心，生命科学学院，分子与细胞生物学实验室，生物医学科学研究所，上海医学院，复旦大学，上海200032，中国。电子地址：yedan@fudan.edu.cn。
⁶美国加州大学圣地亚哥分校药理系和摩尔癌症中心，邮编：92093。电子地址：kuguan@ucsd.edu。
⁷基因工程国家重点实验室、生命科学学院遗传与发展协同创新中心、复旦大学上海医学院生物医学研究所分子与细胞生物学实验室，上海200032；美国北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系Lineberger综合癌症中心，地址：北卡罗来那州教堂山教堂山，邮编：27599。电子地址：yxing@email.unc.edu。

PMID： 25601757
PMCID公司：项目经理4336627
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2014.12.023

WT1招募TET2调节其靶基因表达并抑制白血病细胞增殖

王一平等。分子电池. 2015.

.2015年2月19日；57(4):662-673.

doi:10.1016/j.molcel.2014.12.023。 Epub 2015年1月15日。

作者

附属公司

¹基因工程国家重点实验室，基因与发展协同创新中心，生命科学学院，分子与细胞生物学实验室，生物医学科学研究所，上海医学院，复旦大学，上海200032，中国。
²基因工程国家重点实验室、生命科学学院遗传与发展协同创新中心、复旦大学上海医学院生物医学研究所分子与细胞生物学实验室，上海200032；美国北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系Lineberger综合癌症中心，地址：北卡罗来那州教堂山教堂山，邮编：27599。
^三美国北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系Lineberger综合癌症中心，地址：北卡罗来那州教堂山教堂山，邮编：27599。
⁴上海交通大学医学院瑞金医院上海血液研究所，上海200025。
⁵基因工程国家重点实验室，基因与发展协同创新中心，生命科学学院，分子与细胞生物学实验室，生物医学科学研究所，上海医学院，复旦大学，上海200032，中国。电子地址：yedan@fudan.edu.cn。
⁶美国加州大学圣地亚哥分校药理系和摩尔癌症中心，邮编：92093。电子地址：kuguan@ucsd.edu。
⁷复旦大学上海医学院生物医学科学研究院分子与细胞生物学实验室生命科学学院遗传与发展协同创新中心基因工程国家重点实验室，上海200032；美国北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系Lineberger综合癌症中心，地址：北卡罗来那州教堂山教堂山，邮编：27599。电子地址：yxing@email.unc.edu。

PMID： 25601757
PMCID公司：项目经理4336627
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2014.12.023

摘要

TET2 DNA双加氧酶通过调节DNA甲基化和大量基因的表达来调节细胞特性并抑制肿瘤发生。与大多数其他染色质修饰酶一样，TET2如何被招募到特定的基因组位点尚不清楚。在这里，我们报道了WT1，一种序列特异性转录因子，在急性髓细胞白血病（AML）中与TET2、IDH1和IDH2以互斥方式发生突变。WT1与TET2相互作用，并将其招募到目标基因以激活其表达。多个AML衍生的TET2突变破坏了WT1和TET2之间的相互作用。TET2以依赖于WT1的方式抑制白血病细胞增殖和集落形成。这些结果提供了将TET2靶向基因组中特定DNA序列的机制。我们的结果还解释了急性髓性白血病中WT1和TET2突变的互斥性，并提示IDH1/2-TET2-WT1通路在抑制急性髓性淋巴瘤中的作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。TET2激活WT1靶基因**
**（A）**体细胞变异*IDH1/2，TET2*和*工作任务1*共有1057例AML病例，其中303例至少携带一种突变。数据收集自六项不同的研究（2013年；Fernandez-Mercado等人，2012年；Liang等人，2013年；Patel等人，2012；Rocquain等人，2010；Welch等人，2012）**（B）**的重叠*IDH1/2，TET2*和*工作任务1*303例AML突变病例的突变。**（C）**标记的全长TET2在HEK293T细胞中过度表达，通过qRT-PCR测定WT1靶基因的mRNA表达。**（D）**TET2在有或无稳定HL-60细胞中的过度表达*工作任务1*击倒。用表达不同shRNAs的逆转录病毒转导HL-60细胞*工作任务1*和表达Flag标记的全长TET2的逆转录病毒。western blot检测WT1和TET2蛋白的表达。**（E）**如（D）所述产生稳定的HL-60细胞，并通过qRT-PCR测定WT1靶基因的mRNA表达。**（F）**将过表达TET2 Flag的稳定HL-60细胞或空载体对照用指定浓度的细胞可渗透的D-2-HG处理12小时。通过qRT-PCR测定WT1靶基因的mRNA表达。所示为标准偏差（S.D.）下三倍结果的平均值。另请参见图S1。

**图2。TET2直接绑定到WT1**
**（A）**从两个人类AML细胞系（即KG-1和HL-60）中免疫沉淀内源性WT1蛋白，然后通过western blot检测TET2。正常兔IgG作为阴性对照。**（B）**从小鼠ES细胞或骨髓（BM）细胞免疫沉淀内源性Wt1蛋白，然后通过western blot检测Tet2。正常兔IgG作为阴性对照。**（C）**用表达指示基因的质粒瞬时转染HCT116细胞。使用指示的抗体通过IP-western检测蛋白质相互作用。**（D）**如示意图所示，野生型WT1及其缺失突变体与Flag-TET2在HEK293T细胞中共同表达。使用指示的抗体通过IP-western检测蛋白质相互作用。**（E）**如示意图所示，野生型TET2及其缺失突变体与WT1-HA在HEK293T细胞中共同表达。使用指示的抗体通过IP-western检测蛋白质相互作用。**（F–G）**重组标记-6xHis-TET2^光盘将从感染杆状病毒的Sf9细胞纯化的（200 ng）和Flag-WT1（400 ng）蛋白一起培养。然后添加镍珠，用咪唑洗脱结合蛋白并通过SDS-PAGE进行拆分。WT1-TET2型^光盘结合用western blot（F）或SYPRO Ruby染色（G）检测。另请参见图S2。

**图3。TET2被WT1招募到其靶基因**
**（A）**标记-TET2在HEK293T细胞中以单一或WT1-HA的形式瞬时表达。用ChIP-qPCR（上部）测定WT1靶基因启动子区Flag-TET2的占有率，用hMeDIP-qPCR（下部）测定Flag-TET2结合位点5hmC的富集率。小鼠IgG和兔IgG分别作为ChIP-qPCR和hMeDIP-qPCR的阴性对照。**（B）**在HEK293T细胞中，TET2的标记野生型（WT）TET2或其催化非活性突变体（CM）暂时单一或与HA-WT1过度表达。使用GluMS-qPCR测定位点特异性5hmC和5mC水平。a、 b表示每个目标基因的MspI/HapII识别位点。箭头表示启动子方向。**（C）**稳定的HL-60细胞，内源性基因敲除*TET2测试*如图S3C所示，生成标记的TET2的put-back。通过ChIP-qPCR测定TET2 Flag和内源性WT1在所指示的WT1靶基因的启动子区域上的占有率。包括小鼠IgG和兔IgG作为阴性对照。箭头表示启动子方向，CGI（绿线）表示CpG岛，红色虚线表示WT1结合基序。**（D）**用表达不同shRNAs的逆转录病毒转导（C）中稳定的HL-60细胞*工作任务1*通过ChIP-qPCR确定TET2-Flag在所示WT1靶基因启动子区域的占有率。小鼠IgG作为阴性对照。**（E）**用表达不同shRNAs的逆转录病毒转导HL-60细胞*工作任务1*和/或*TET2测试*如图S3F所示。使用GluMS-qPCR测定5hmC和5mC的位点特异性水平。**（F）**通过qRT-PCR检测（E）中稳定的HL-60细胞的指示WT1靶基因的mRNA表达。所示为标准偏差（S.D.）下三倍结果的平均值。*表示所示比较的P<0.05；**对于指示的比较，表示P<0.01；n.s.=不重要。另请参见图S3。

**图4。TET2以WT1依赖性方式抑制白血病细胞增殖**
**（A–B）**稳定HL-60细胞过度表达全长TET2的细胞增殖（A）和集落形成（B）*工作任务1*分别通过细胞计数和克隆形成试验检测敲除。**（C–D）**稳定HL-60细胞的细胞增殖（C）和集落形成（D）*工作任务1*和/或*TET2测试*分别用细胞计数法和克隆形成法测定。**（E）**稳定KG-1细胞的细胞增殖*工作任务1*和/或*TET2测试*通过细胞计数测定。所示为标准偏差（S.D.）下三倍结果的平均值*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示所示比较的p<0.001。n.s.=不重要。另请参见图S4。

**图5。TET2中AML衍生突变破坏WT1结合**
**（A）**用编码HA标记野生型TET2的载体瞬时转染HL-60细胞^光盘或AML衍生的WT1-binding缺陷的TET2突变体，并且体外表达的TEM2蛋白被免疫沉淀，然后通过western blot检测内源性WT1。**（B）** 体外TET2催化活性测定。从人类单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）细胞中分离出基因组DNA，用免疫纯化的HA标记野生型和突变体人类TET2在37°C下进行超声处理并孵育2小时。反应终止后，使用5mC、5hmC、，5fC和5caC。有关更多详细信息，请参阅实验程序。用亚甲蓝染色法检测每个反应中的DNA含量。CM是指TET2的一个催化突变，含有两个破坏与铁结合的突变²⁺ **（C）**用编码HA标记野生型TET2的慢病毒载体转导HL-60细胞^光盘，或AML衍生的WT1结合缺陷TET2^光盘突变体和异位TET2的表达^光盘蛋白质测定采用westernblot。**（D–F）**如上文（C）所述，生成稳定的HL-60细胞。用hMeDIP-qPCR（D）检测所示WT1靶基因启动子区TET2结合位点的5hmC富集，将兔IgG作为阴性对照。此外，用GluMS-qPCR（E）测定5hmC和5mC的位点特异性水平，用qRT-PCR（F）测定WT1靶基因的mRNA表达。所示为标准偏差（S.D.）下三倍结果的平均值*表示p<0.05，**表示所示比较的p<0.01。n.s.=不重要。另请参见图S5。

**图6。AML衍生的WT1结合缺陷的TET2突变体不能抑制白血病细胞增殖**
**（A–B）**表达HA-TET2野生型或WT1结合缺陷突变体的稳定HL-60细胞的细胞增殖（A）和集落形成（B）^光盘分别用细胞计数法和克隆形成法测定。**（C）**AML抑制中IDH1/2-TET2-WT1通路的示意图。另见表S2。

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中的注释

WIT治疗白血病的新途径。
Sardina JL、Graf T。 Sardina JL等人。分子细胞。2015年2月19日；57(4):573-574. doi:10.1016/j.molcel.2015.02.005。分子细胞。2015. PMID：25699704

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