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.2015年2月27日；290(9):5533-42.
doi:10.1074/jbc。M114.598011。 Epub 2015年1月9日。

脂联素通过促进金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）分泌减少肝星状细胞迁移

迈赫迪·拉梅扎尼·莫哈达姆 1, 以王建华 1, 维基·何 1, 特里斯坦·J·伊塞利 1, 巴德·阿尔扎赫拉尼 1, 徐爱民 2, 大卫·范德普滕 1, 梁乔 1, 杰克佐治 1, 莱昂内尔·赫巴德 三
附属公司

脂联素通过促进金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）分泌减少肝星状细胞迁移

迈赫迪·拉梅扎尼·莫哈达姆等人。 生物化学杂志. .

摘要

肝星状细胞（HSC）是肝纤维化的中心参与者，当其活化、增殖、迁移至肝损伤部位并分泌细胞外基质。肥胖是已知的肝纤维化危险因素，与脂联素、，在体内抑制肝纤维化并在体外限制HSC增殖和迁移的蛋白质。脂联素介导的一磷酸腺苷活化激酶（AMPK）的激活抑制HSC增殖，但其限制HSC迁移到损伤部位的机制尚不清楚。在这里，我们试图阐明脂联素如何调节HSC运动。在迁移试验中分离原代大鼠HSC并用脂联素处理。通过四氯化碳处理小鼠12周，然后注射脂联素来检测脂联素的体内作用。收集细胞和组织样本，并对其进行基因表达、信号传递和组织学分析。检测肝纤维化患者血清中脂联素和金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）蛋白。向小鼠注射脂联素可增加TIMP-1基因和蛋白的表达。在培养的HSC中，脂联素促进了TIMP-1的表达，并通过TIMP-1与CD63/β1-整合素复合物的结合降低了黏着斑激酶的磷酸化以限制HSC的迁移。在患有肝纤维化的小鼠中，脂联素具有类似的作用，并且限制了黏着斑激酶磷酸化。最后，在晚期纤维化患者中，血清脂联素与TIMP-1水平呈正相关。总之，这些数据表明，脂联素刺激HSC分泌TIMP-1，延缓其迁移，并有助于脂联素的抗纤维化作用。

关键词：脂联素；纤维化；肝脏；四spanin；金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）。

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数字

图1。
图1。
脂联素降低HSC增殖和α-SMA表达体内.fAd注射后天狼星红（胶原）染色无变化（10倍放大）(A类)，Ki67测定的HSC增殖减少(绿色)和α-SMA(红色)共染色(酒吧，50μm）DAPI(蓝色) (B类)，α-SMA降低(浅灰色)表达式（10倍放大）(C类)TUNEL测定凋亡无变化(TUN（调谐）;绿色)和α-SMA(红色)共染色(酒吧，50微米）(D类). 这个箭头表示浅绿色共定位细胞，以及插入表示2倍放大的双重标记细胞。*，第页值<0.05。
图2。
图2。
脂联素促进TIMP-1表达并抑制FAK活性体内.fAd注射小鼠肝脏TIMP-1表达增加3倍(A类)，WT患者血清TIMP-1升高（不显著）(B类)与安慰剂治疗的WT相比，增加了肝脏p-AMPK/AMPK比率，降低了pFAK/FAK比率和α-SMA蛋白水平(C类和D类).E类fAd（0–15μg/ml）治疗HSC可促进TIMP-1基因表达。F类fAd（5μg/ml）处理活化的HSC可增加TIMP-1蛋白分泌。G公司6小时后，应用AMPK拮抗剂化合物C(C-C公司) (20 μ米)或腺嘌呤9-β-d日-阿拉伯呋喃糖苷(阿拉伯联合酋长国; 1米米)与单用fAd相比，fAd（5μg/ml）降低了TIMP-1蛋白水平。第页被认为显著的值<0.05、0.001和<0.0001分别用*、**和***表示。公共有限公司，安慰剂。
图3。
图3。
脂联素逆转活化HSC的纤维化表型。 A类，用fAd（5μg/ml）或AMPK激动剂氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷治疗HSC(AICAR公司; 2米米)24小时后，BrdU掺入量分别减少了3倍和2倍。拮抗化合物C的应用(科科斯群岛; 20 μ米)fAd 24小时逆转增殖。B类fAd处理HSC使caspase 3活性增加2倍。C类Western blot分析显示，与对照HSC相比，fAd处理的αSMA蛋白表达下调2倍。D类，免疫荧光染色显示α-SMA(红色)未经治疗的HSC比经fAd治疗的HSCs大。E类fAd处理使caspase 3活性增加2倍，而IgG控制和TIMP-1阻断抗体则无作用。在未经治疗的HSC中，TIMP-1抗体使caspase 3活性增加1.4倍。F类fAd减少增殖和IgG控制，TIMP-1阻断抗体没有作用。在未经治疗的HSC中，TIMP-1抗体和rrTIMP-1没有显著作用。第页被视为显著的<0.005、0.001和<0.0001值分别用*、**和***表示(酒吧，100μm）。
图4。
图4。
β1-整合素、CD63和FAK在HSC中形成复合物。 A类Western blot显示大鼠HSC表达β1-整合素、CD63和FAK。B类免疫荧光和共聚焦分析显示FAK(绿色)和CD63(红色)β1-整合素(绿色)和CD63共定位(黄色的)分别为(酒吧，20微米）。C类和D类，邻近配体分析(解放军)检测CD63和β1-整合素的复合物(红色)在大鼠HSC中。第页值=0.001（**）(酒吧，20微米）。E类，CD63免疫沉淀(IP（IP）)原代大鼠细胞的CD63、β1-整合素和大鼠重组TIMP-1被下调。fAd处理LX2细胞使αSMA基因表达降低1.7倍(F类)TIMP-1表达增加2.7倍(G公司).H（H）人LX2细胞的β1-整合素免疫沉淀可降低CD63、FAK和人重组TIMP-1。
图5。
图5。
脂联素刺激的TIMP-1抑制HSC迁移和FAK活性。在迁移试验中，用fAd（5μg/ml）、IgG、CD63和TIMP-1抗体（0.25μg/ml）的组合治疗大鼠HSC。A类，fAd抑制入侵4倍。阻断CD63抗体没有单独作用，但限制了fAd对迁移的作用。对照IgG无影响。B类fAd和TIMP-1抗体联合治疗逆转了fAd对迁移的抑制作用。C类和D类Western blot显示fAd治疗后pFAK/FAK比值显著下调。用CD63或TIMP-1阻断抗体联合治疗可部分逆转fAd对pFAK/FAK的抑制作用。E类CD63 shRNA转导的HSC中CD63基因表达减少55%(紧急停堆)不影响CD63的表达。F–G公司经fAd（5μg/ml）处理的CD63 shRNA慢病毒转导细胞显示，经scr shRNA处理的细胞中pFAK/FAK比率降低了50%，而经CD63 shRNA处理的细胞则降低了30%。与scr shRNA相比，CD63 shRNA转导细胞中的pFAK/FAK水平增加了1.4倍。第页被认为具有显著性的值<0.005、0.001和<0.0001分别用*、**和***表示。
图6。
图6。
血清TIMP-1与脂联素水平呈正相关。 A类酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，高脂血症患者血清TIMP-1升高与低血清脂联素（>10μg/ml）；n个= 14; TIMP-1:372±15纳克/毫升，与<5μg/ml血清脂联素；n个= 14; TIMP-1:255±14纳克/毫升，第页值<0.05）。B类线性回归显示，血清TIMP-1与脂联素水平呈正相关（Spearman相关系数0.71）。C类，模型代表脂联素对HSC的作用，导致AMPK磷酸化增加，随后TIMP-1与CD63的释放和结合，以及FAK的去磷酸化。最终效果是减少HSC的增殖和迁移。
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