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.2014年12月22日；31(6):722-33.
doi:10.1016/j.devcel.2014.11.012。 Epub 2014年12月11日。

衰老细胞通过分泌PDGF-AA在最佳伤口愈合中发挥重要作用

马可·德马里亚 1, 大谷直子 2, 萨米赫·A·优素福 三, 弗朗西斯·罗德尔 1, 温迪·图桑 4, 詹姆斯·米切尔 4, 雷米·马丁·拉贝奇 1, 简·维吉 5, 哈里·范·斯蒂格 6, Martijn E T Dollé 7, Jan H J Hoeijmakers公司 4, 阿兰·德布鲁因 三, 原英治 2, 朱迪斯·坎皮西 8
附属公司

衰老细胞通过分泌PDGF-AA在最佳伤口愈合中发挥重要作用

马可·德马里亚等。 开发人员单元格. .

摘要

细胞衰老通过阻止癌前细胞的生长来抑制癌症，但衰老细胞的积累被认为通过衰老相关分泌表型（SASP）驱动年龄相关的病理学，其功能尚不清楚。为了了解复杂衰老表型的生理作用，我们建立了一个小鼠模型，在该模型中，衰老细胞可以在活体动物中被可视化和消除。我们发现，衰老的成纤维细胞和内皮细胞在皮肤创伤后很早就出现，它们通过分泌血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA）诱导肌成纤维细胞分化，从而加速伤口闭合。在两个小鼠模型中，用重组PDGF-AA局部治疗无衰老伤口，可以缓解伤口闭合延迟和肌成纤维细胞分化不足的问题。这些发现确定了SASP在组织修复中的有益作用，并有助于解释SASP进化的原因。

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数字

图1
图1。p16-3MR细胞的特性
（A） p16-3MR转基因示意图。详见结果和补充实验程序。（B） 非新生（NS）和衰老（SEN；由来自p16-MR胚胎的10Gy IR）MEF诱导的RNA的qRT-PCR分析。对所示基因相对于肌动蛋白mRNA（cDNA数量控制）的mRNA水平进行RNA分析（n=3个独立实验；A.U.，任意单位）。（C） （B）中所述细胞的免疫荧光。蓝色表示DAPI染色的细胞核；红色表示mRFP免疫染色。（D） （B）中所述电池的发光测量。细胞与注射用库伦他嗪孵育并溶解，并使用光度计（n=3；a.U.，任意单位）量化发光强度。（E） 用GCV（10μg/ml）处理WT或p16-MR MEF 7天，并使用MTS分析评估存活细胞的百分比（n=4）。所示数据为平均值±标准偏差。**p<0.01，***p<0.001。
图2
图2。p16-3MR小鼠的特征
（A） 用载体（PBS）或25 mg/kg GCV治疗5天（每日腹腔注射；GCV）的模拟或IR p16-3MR小鼠，注射了可伦他嗪，并使用氙气成像系统量化发光。（B） 从（A）中描述的小鼠脂肪中提取RNA，并通过qRT-PCR定量内源性p16的mRNA水平墨水4amRFP、IL-6、MMP-3和IL-5。以Tubulin mRNA作为对照（n=4）。（C） 24个月大的p16-3MR小鼠在GCV治疗前后的代表性图像。使用氙气成像系统量化发光。（D–F）来自老年（20–24个月）或年轻（3–4个月）p16-3MR小鼠的脂肪活检，用PBS或GCV治疗，如（A）所述。（D） 活体组织切片用注射用的库伦他嗪溶液孵育，并用氙气成像系统定量发光。（E） 活检用福尔马林固定，用X-Gal溶液在pH 6下染色，以测量SA-β-Gal活性，并用光扫描仪记录。（F） 从活检中提取RNA并通过qRT-PCR定量内源性p16的mRNA水平墨水4a肌动蛋白mRNA作为对照（n=4）。数据显示为平均值±SD。**p<0.01***p<0.001。
图3
图3。衰老细胞是皮肤创面最佳愈合所必需的
在所有情况下，在小鼠背部皮肤上用6mm的冲头打伤，并在受伤后1至6天内用PBS（溶媒对照）或GCV（每天腹腔注射5次）进行治疗（n=每组至少4只小鼠）。（A和B）使p16-3MR小鼠受伤，腹腔注射腔肠他嗪，并在受伤后的指定时间用Xenogen成像系统成像。（A） 发光的量化。（B） 受伤后指定时间（天）的典型图像。（C） 伤后6天收集p16-MR小鼠的皮肤活检，固定并染色细胞核（DAPI；蓝色）或mRFP（免疫染色；红色）。白色星号表示伤口边缘。（D–F）第16页墨水4a（D） 通过qRT-PCR对p16-3MR小鼠在损伤后指定的时间间隔内从PBS或GCV治疗伤口切取的皮肤活检组织中的mRFP（E）和p21（F）mRNA水平进行定量。用肌动蛋白控制cDNA数量。（G） 在受伤后的指定天数测量WT或p16-3MR小鼠的伤口大小。（H） p16-3MR小鼠受伤后指定天数的典型伤口图像。（一） 在受伤后的指定天数测量WT、p16 KO、p21 KO和p16/p21 DKO小鼠的伤口大小。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。
图4
图4。创伤愈合过程中诱导衰老细胞的特征
（A） 伤后6天收集PBS治疗小鼠（载物，左面板）和GCV治疗小鼠（右面板）（n=8）的伤口纵切面，用H&E或特异性抗体染色并评分。皮肤被定义为D，表皮被定义为E。在H&E染色中，黑色和绿色箭头分别表示原始伤口边缘和重新上皮化的边缘。比例尺代表500μm。切片还用Masson三色（胶原纤维）或抗SMA抗体（肌成纤维细胞标记物）、波形蛋白（间充质细胞标记）或第VIII因子（内皮细胞标记）染色。方框区域的放大倍数较高显示在右下方。阳性染色用箭头表示。比例尺表示主面板为100μm，插件为20μm。（B） 表显示了损伤后上皮化的百分比以及基于（A）中所示染色的血管生成、肉芽化和炎症的组织学评分。（C和D）伤后6天收集的伤口细胞被分离并分类用于RFP。用qRT-PCR定量编码所示蛋白的mRNA水平。肌动蛋白被用作RNA数量的对照（n=3个独立实验）。（E） 对（A）中描述的切片进行p21的免疫染色。黑色箭头表示成纤维细胞阳性，绿色箭头表示内皮细胞阳性。插图显示该部分的放大倍数较高。比例尺表示主面板200μm，插件40μm。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。
图5
图5。衰老细胞表达和分泌PDGF-A
（A） 如图4D所示，通过qRT-PCR对从伤口分离的细胞中所示蛋白的mRNA水平进行量化。肌动蛋白用于控制RNA数量（n=3）。（B） 在损伤后的指定时间间隔收集从PBS或GCV治疗的p16-3MR小鼠伤口切除的皮肤活检，并通过qRT-PCR定量PDGFA mRNA水平。肌动蛋白用于控制RNA的数量（n=5）。（C） 伤后6天收集p16-MR小鼠的皮肤活检，固定，用DAPI（蓝色；指示细胞核）染色，并对mRFP（红色）和PDGF-A（绿色）进行免疫染色。（D） 伤后6天从伤口中提取细胞，并进行RFP分类。招标书+24小时后将细胞固定，然后用DAPI（蓝色）染色，并对PDGF-A（红色）和波形蛋白（绿色，左侧面板）或因子VIII（绿色，右侧面板）进行免疫染色。（E和F）小鼠皮肤成纤维细胞（SF）或内皮细胞（EC）受到模拟辐射（NS）或辐射致衰老（SEN；10Gy X射线）。照射后4天，收集RNA和条件培养基，分别用qRT-PCR和ELISA分析PDGF-A mRNA和分泌蛋白（n=4）。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。
图6
图6。衰老相关PDGF-A促进肌成纤维细胞分化
（A和B）皮肤成纤维细胞与含有非特异性兔IgG或PDGF-A阻断抗体的IR诱导衰老（CM SEN）或非衰老（CM NS）细胞的条件培养基孵育；48小时后，细胞进行SMA（绿色）免疫染色，细胞核进行DAPI（蓝色）染色。使用10 ng/ml重组PDGF-AA作为阳性对照。（A） 代表性形象。（B） SMA阳性细胞占细胞总数（DAPI阳性）的百分比（n=6）。（C和D）伤口愈合如图3G所示，但PDGF-AA（20 ng）或载药（PBS）在受伤后1至6天每天局部施用（n=5）。（C） 伤后6天的伤口活检用石蜡包埋，并进行SMA染色。该图显示了伤口间隙中阳性细胞的百分比。（D） 在受伤后的指定时间测量伤口大小。除上述各组外，还对一组p16-3MR对照小鼠进行PDGF-RA治疗（损伤后1至6天每天局部应用20 ng）。（E） 在WT和p16/p21双基因敲除小鼠损伤6天后，从损伤部位分离RNA。通过qRT-PCR定量PDGFA mRNA水平。肌动蛋白用于控制RNA数量（n=3）。（F） 按照（B）所述进行伤口愈合和测量。伤后1至6天每天局部涂抹PDGF-AA（20 ng）或载药（PBS）（n=3）。所示数据为平均值±标准差。***p<0.01，***p<0.01。
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中的注释

  • 衰老有助于再生。
    塞拉诺M。 塞拉诺M。 开发单元。2014年12月22日；31(6):671-2. doi:10.1016/j.devcel.2014.12.007。 开发单元。2014 PMID：25535913

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