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.2014年11月10日；26(5):754-69.

doi:10.1016/j.cell.2014.09.008。 Epub 2014年10月23日。

Rab1A是一个mTORC1激活物和结肠直肠癌基因

珍妮斯·德·托马斯¹, 张燕杰², 岳华伟^三, 朱洪秋^三, 劳拉·莫里斯^三, 王慧云⁴, X F史蒂文·郑⁵

附属公司

附属公司

¹美国新泽西州新不伦瑞克市小奥尔巴尼街195号新泽西州立大学罗格斯罗格斯癌症研究所，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854。
²美国新泽西州新不伦瑞克市小奥尔巴尼街195号新泽西州立大学罗格斯罗格斯癌症研究所，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA；上海交通大学医学院附属第三人民医院消化科，上海201900。
^三新泽西州立大学罗格斯分校细胞和分子药理学研究生项目，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA。
⁴新泽西州罗格斯癌症研究所，罗格斯，新泽西州立大学，195 Little Albany Street，New Brunswick，NJ 08903，美国；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA；中山大学肿瘤中心，华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心，广州510060，中国。
⁵美国新泽西州新不伦瑞克市小奥尔巴尼街195号新泽西州立大学罗格斯罗格斯癌症研究所，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA；中山大学肿瘤中心，华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心，广州510060，中国。电子地址：zhengst@cinj.rutgers.edu。

PMID： 25446900
预防性维修识别码：项目经理4288827
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2014.09.008

Rab1A是一个mTORC1激活物和结肠直肠癌基因

珍妮斯·德·托马斯等。癌细胞. 2014.

.2014年11月10日；26(5):754-69.

doi:10.1016/j.cell.2014.09.008。 Epub 2014年10月23日。

作者

珍妮斯·德·托马斯¹, 张燕杰², 岳华伟^三, 朱洪秋^三, 劳拉·莫里斯^三, 王慧云⁴, X F史蒂文·郑⁵

附属公司

¹新泽西州罗格斯癌症研究所，罗格斯，新泽西州立大学，新泽西州新不伦瑞克小奥尔巴尼街195号，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854。
²美国新泽西州新不伦瑞克市小奥尔巴尼街195号新泽西州立大学罗格斯罗格斯癌症研究所，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA；上海交通大学医学院附属第三人民医院消化科，上海201900。
^三新泽西州立大学罗格斯分校细胞和分子药理学研究生项目，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA。
⁴美国新泽西州新不伦瑞克市小奥尔巴尼街195号新泽西州立大学罗格斯罗格斯癌症研究所，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA；中山大学肿瘤中心，华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心，广州510060，中国。
⁵美国新泽西州新不伦瑞克市小奥尔巴尼街195号新泽西州立大学罗格斯罗格斯癌症研究所，邮编08903；新泽西州立大学罗格斯分校罗伯特·伍德·约翰逊医学院药理学系，地址：675 Hoes Lane，Piscataway，NJ 08854，USA；中山大学肿瘤中心，华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心，广州510060，中国。电子地址：zhengst@cinj.rutgers.edu。

PMID： 25446900
预防性维修识别码：项目经理4288827
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2014.09.008

勘误表in

Rab1A是一种mTORC1激活剂和大肠癌基因。
Thomas JD、Zhang YJ、Wei YH、Cho JH、Morris LE、Wang HY、Zheng XFS。 Thomas JD等人。癌细胞。2016年7月11日；30(1):181-182. doi:10.1016/j.cell.2016.06.014。Epub 2016年7月11日。癌细胞。2016 PMID：27479033 没有可用的摘要。

摘要

氨基酸（AA）是一种有效的有丝分裂原，控制生长和代谢。在这里，我们描述了Rab1作为AA信号传导至mTORC1的保守调节因子的鉴定。AA刺激高尔基体内Rab1A GTP与mTORC1和Rheb-mTORC2的结合和相互作用。Rab1A过度表达以AA和mTORC1依赖的方式促进mTORC1-信号传导和致癌生长。相反，Rab1A敲除选择性地减弱Rab1过度表达癌细胞的致癌生长。此外，Rab1A在结直肠癌（CRC）中过度表达，这与mTORC1信号升高、肿瘤侵袭、进展和预后不良有关。我们的结果表明，Rab1是一种mTORC1激活剂和癌基因，通过Rab1A过度表达的AA信号过度激活可促进肿瘤发生，并使癌细胞易于接受mTORC1-靶向治疗。

版权所有©2014 Elsevier Inc.保留所有权利。

PubMed免责声明

数字

图1。Ypt1/Rab1对AA激活酵母中的TORC1至关重要
（A）全球技术法规通过斑点试验（10倍连续稀释）检测野生型（WT）和突变酵母细胞对雷帕霉素的敏感性。（B）重量，gtr1Δ和全球技术法规2Δ细胞缺乏AA并重新刺激。通过免疫印迹法检测HA-Sch9和Maf1-Myc磷酸化的TORC1信号。（C）表达Gtr1-GTP或Gtr2-GDP的酵母从AA中饥饿并重新刺激，并如上所述检测TORC1信号。（D）对WT和液泡生物发生突变体进行饥饿处理，然后用AA重新刺激，并检测TORC1信号。（E）测定非必需Rab基因缺失突变体对雷帕霉素的敏感性。托1Δ应变用作阳性对照。（F）对WT和Tet-off基本Rab突变株进行雷帕霉素敏感性分析，包括是否使用强力霉素（Dox）。（G） WT和密码1对温度敏感的(密码1-ts)在允许温度下检测突变体对雷帕霉素的敏感性。（H） WT和测试-YPT1在Dox存在或不存在的情况下，用AA对细胞进行饥饿和再刺激，并检测TORC1信号。（I）重量，pt6Δ和pt7Δ细胞饥饿后用AA重新刺激，并检测TORC1信号。另请参见图S1。

图2。Rab1A对AA在人类细胞中激活mTORC1至关重要
（A）对感染慢病毒Rab1A shRNAs的HEK293E细胞进行P-S6K1（T389）、S6K、P-AKT（S473）、AKT和PARP裂解分析。（B）将感染Rab1A shRNA的HEK293E细胞饥饿，用AA再刺激10分钟，并分析P-S6K1（T389）。（C）将HEK293E细胞从血清中饥饿（除血清外的全部培养成分），用100 ng胰岛素重新刺激10 min，并分析P-S6K1（T389）。（D）免疫沉淀内源性Rab1A并分析mTOR和Raptor的存在。（E） WT和突变型HA-Rab1A在HEK293E细胞中瞬时表达。对mTOR进行免疫沉淀，并分析其与HA标记蛋白和内源性猛禽的相互作用。HA-Rap2A为阴性对照。（F）³²P标记的HEK293E细胞被饥饿并用AA重新刺激。Rab1A被免疫沉淀并分析其结合³²用薄层色谱法对P标记的GTP和GDP进行分析。底部的数字表示三个独立实验中的±SD。（G）将HEK293E细胞饥饿并用AA重新刺激。细胞提取物与GTP-琼脂糖珠孵育，并用Western blot分析Rab1A的结合。底部面板显示了三个独立实验中的平均值±SD。（H）将表达Myc-mTOR和WT或突变体HA-Rab1A蛋白的HEK293E细胞饥饿并用AA再刺激。通过共-IP分析Myc-mTOR和HA-Rab1A的相互作用。HA-Rap2A为阴性对照。（一）与图2H相同，但通过P-S6K1分析了mTORC1信号。Rheb用作阳性对照。（J）与图2G相同，只是细胞被饥饿并用血清重新刺激。底部面板显示了三个独立实验中的平均值±SD。另请参见图S2

图3。Rab1A刺激高尔基体中mTORC1信号传导并调节Rheb-mTORC2相互作用
（A）在存在或不存在过表达RagB/RagC或Rheb的情况下，感染Rab1A shRNA或对照shRNA的HEK293E细胞用AA（含有除AA外的所有培养成分）饥饿，并用AA再刺激10分钟。用Western blot分析Rab1A敲低对P-S6K1的影响。（B）用抗RagA/RagB或Rheb的慢病毒shRNA感染过度表达HA-Rab1A的HEK-293E细胞，然后进行AA饥饿和再刺激处理。Western blot检测对mTORC1信号转导的影响。（C）使用Duolink检测瞬时表达GM130-GFP（高尔基，绿色）的HEK293E细胞中内源性Rab1A和猛禽（红色）的相互作用。所示为代表性图像（n>350）。比例尺=10μm。（D） Duolink用于检测瞬时表达GM130-GFP（高尔基体，绿色）的HEK293E细胞中内源性Rheb和Raptor（红色）的相互作用。所示为代表性图像（n>350）。比例尺=10μm。（E）与图3E相同，但图像通过共焦显微镜进行分析。所示为共焦图像的Z截面。箭头表示高尔基位置。比例尺=10μm。（F）用Rab1A siRNA或对照siRNA转染HEK293E细胞，并用免疫荧光（IF）显微镜分析Rab1A蛋白。比例尺=10μm。（G）在存在Rab1A或对照siRNA的情况下，通过Duolink（Red）分析瞬时表达GM130-GFP（绿色）的HEK293E细胞与Rheb-Raptor的相互作用。图中显示了一幅代表性图像（n>350）。比例尺=10μm。参见图S3

图4。Rab1A经常是过度表达的CRC，这与mTORC1信号过度活跃和生存率低有关
（A）人原发性CRC组织芯片和邻近非癌组织的IHC染色。图示为代表高、低和阴性Rab1A染色的肿瘤和非癌组织切片。比例尺=50μm。（B）方框图显示了Rab1A在大肠癌和邻近非癌组织中表达的统计分析。（C）散点图显示单个肿瘤中的Rab1A染色水平与CRC中Rab1A与配对非癌组织的比率。（D）对连续的CRC组织切片进行Rab1A和P-S6K1染色。所示为Rab1A染色高、中度或阴性，以及P-S6K1染色的代表性病例。比例尺=100μm。（E） Rab1A和P-S6K1 IHC染色的相关图（任意单位）。相关性通过非参数Spearman检验进行评估。指出了案例数（n）、相关系数（r）和p值（p）。（F） Rab1A和P-S6K1水平异质性病例中Rab1A与P-S6K1.的相关性。红色箭头：高Rab1A-阳性/P-S6K1染色；黑色箭头：低Rab1A阳性/P-S6K1染色。比例尺=50μm。（G）根据Rab1A阳性染色中值将CRC病例分为两组进行Kaplan-Meier生存分析。p值通过Log-rank检验计算。另见表S1。

图5。Rab1A过度表达是CRC增长的驱动因素
（A）通过免疫印迹（顶部）分析一组人CRC细胞系的Rab1A、P-S6K1（T389）和P-AKT（473）水平，并确定Rab1A水平和P-S6K1（T389的水平之间的相关性（底部，如图2E所示）。（B）如图所示，在代表Rab1A高、中、低表达的三对CRC细胞系中敲除Rab1A，并通过免疫印迹分析其对P-S6K1（T389）、S6K、P-AKT（S473）和AKT的影响。（C–E）Rab1A在表达高（C）、中（D）或低（E）水平Rab1A的人CRC细胞系中被敲除，并通过SRB测定分析这些细胞的相对生长。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD。在表达高（F）、中（G）或低（H）水平Rab1A的人CRC细胞系中，（F–H）Rab1A被敲除，并测定其形成集落的能力。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD（12孔板中的菌落数/孔）。（I，J）肿瘤生长定量结果（I）和研究结束时解剖的肿瘤代表性图像（J），显示Rab1A基因敲除对DLD-1异种移植瘤生长的影响。数据表示平均值±SD。（K）DLD1异种移植瘤通过苏木精-伊红（HE）染色和IHC进行分析，如图所示。有丝分裂指数用每个高倍场（HPF）的有丝分裂核数表示。比例尺=50μm。另请参见图S4。

图6。Rab1A而不是活化的PI3K或MEK对大肠癌中mTORC1信号传导和致癌生长至关重要
（A） DLD1和HCT116亲本细胞、Rab1A敲除或WT或突变（MT）缺失的细胞PIK3CA公司分析P-S6K1、S6K1，P-AKT和AKT水平的等位基因。（B–E）父母、Rab1A击倒或WT或MTPIK3CA公司分析等位基因缺失的DLD1（B，C）和HCT116（D，E）细胞的细胞生长（B，D）和集落形成（C，E）。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD。（F–H）在含有不同量AA（F）、血清（G）或葡萄糖（H）（正常值的1倍、0.75倍、0.5倍、0.25倍）的培养基中检测具有差异Rab1A表达的CRC细胞系的生长。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD。另请参见图S5。

图7。Rab1A过度表达促进致癌转化和致癌生长
（A） NIH3T3或NIH3T3/H-Ras^第12版对稳定表达GFP或GFP-Rab1A的细胞进行P-S6K1（T389）分析。（B） NIH3T3或NIH3T3/H-Ras的生长^第12版过表达Rab1A的细胞。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD。所示为任意单位。（C） NIH3T3或NIH3T_3/H-Ras菌落形成的代表性图像（顶部）和量化结果（底部）^第12版细胞过度表达Rab1A（三个独立的三次重复实验的平均值±SD）。所示为每孔菌落数（12孔板）。（D） NIH3T3或NIH3T3/H-Ras病灶形成分析的代表性图像^第12版Rab1A过度表达或不过度表达的细胞。比例尺=100μm。（E） NIH3T3或NIH3T3/H-Ras非锚固生长的代表性图像^第12版Rab1A过度表达或不过度表达的细胞。（F–G）将稳定表达GFP或GFP-Rab1A的NIH3T3细胞皮下注射到裸鼠的侧翼，并每三天测量一次肿瘤体积。显示了实验结束时解剖肿瘤的代表性图像（F）和肿瘤生长的量化（G）。图7F底部的数字显示了形成的异种移植瘤的数量和百分比。数据表示平均值±SD。（H）具有代表性的异种移植瘤NIH3T3/GFP-Rab1A肿瘤组织切片，显示染色。通过对每个肿瘤的10个随机高功率场（HPF，400×）进行形态学评估，获得有丝分裂指数。数据代表有丝分裂指数（按Student’st吨测试）。比例尺=50μm。插入比例尺=10μm。（一）分析稳定表达GFP或GFP-Rab1A的RKO细胞的mTORC1信号。（J）通过SRB法测定过表达GFP或GFP-Rab1A的RKO细胞的生长情况。数据表示平均值±SD。（K）过度表达GFP或GFP-Rab1A的RKO细胞被确定为集落形成。所示为代表性图像。将稳定表达GFP或GFP-Rab1A的（L–M）RKO细胞皮下注射到裸鼠两侧，每隔三天测量肿瘤体积。显示了实验结束时解剖肿瘤的代表性图像（L）和肿瘤生长的量化（M）。数据表示RKO异种移植瘤组织的平均值±SD（N）HE染色和Rab1A和P-S6K1水平的IHC染色。比例尺=50μm。另请参见图S6。

图8。Rab1A过表达促进mTORC1依赖性致癌生长并增强雷帕霉素敏感性
（A）用10 nM雷帕霉素处理48小时后CRC细胞的相对生长抑制。（B）用雷帕霉素或药物载体（NS）处理DLD-1或RKO荷瘤动物，并测量肿瘤生长。图示为治疗结束时解剖的典型肿瘤。数据表示平均值±SD。IHC分析雷帕霉素或药物载体治疗的DLD-1和RKO肿瘤的P-S6K1。比例尺=50μm。（D）用10 nM雷帕霉素处理过表达GFP或GFP-Rab1A的NIH3T3细胞，并检测mTORC1信号和细胞生长。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD。（E）用10nM雷帕霉素处理稳定表达GFP或GFP-Rab1A的RKO细胞，并测定mTORC1信号传导和集落形成。数据表示三个独立的三次重复实验的平均值±SD。（F）比较Rab1和Rag介导的AA激活mTORC1的模型。Rab1与Rag GTPases分别代表锚定在高尔基体和溶酶体上的两个不同的AA信号分支，通过Rheb激活mTORC 1以响应AA的充足。

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中的注释

mTORC1 gRAB高尔基人。
Sanchez-Gurmaches J，Guertin DA。 Sanchez-Gurmaches J等人。癌细胞。2014年11月10日；26(5):601-3. doi:10.1016/j.cell.2014.10.011。Epub 2014年11月10日。癌细胞。2014 PMID：25517745

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