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.2014年10月23日：13:239。
doi:10.1186/1476-4598-13-239。

MYC调节内分泌抵抗乳腺癌的未折叠蛋白反应和葡萄糖和谷氨酰胺摄取

Ayesha N Shajahan-Haq公司 1, 凯瑟琳·库克, 杰西卡·施瓦茨·罗伯茨, 阿赫里杰·埃尔塔伊布, 黛安·M·德玛斯, 安妮·马·瓦里, 卡罗琳·O·B·脸, 丽娜A Hilakivi-Clarke, 罗勃·克拉克
附属公司

MYC调节内分泌抵抗乳腺癌的未折叠蛋白反应和葡萄糖和谷氨酰胺摄取

Ayesha N Shajahan-Haq公司等。 摩尔癌症. .

摘要

背景：大约70%的乳腺癌是雌激素受体α阳性（ER+），并用抗雌激素治疗。然而，50%的ER+肿瘤对这些药物产生耐药性（内分泌阻力）。在内分泌抵抗细胞中，一种称为未折叠蛋白反应（UPR）的适应性途径升高，使细胞比敏感细胞更有效地耐受应激。虽然确切的机制尚不清楚，但普遍定期审议可以引发促生和促死结果，这取决于压力的性质和程度。在这项研究中，我们确定了MYC，一种在内分泌抗性乳腺癌中上调的癌蛋白，作为葡萄糖缺乏条件下UPR的调节器。

方法：ER+人乳腺癌细胞系（LCC1、LCC1、LY2和LCC9）和大鼠乳腺肿瘤用于证实MYC在内分泌抵抗中的上调。为了评估蛋白质的功能相关性，使用了siRNA介导的抑制或小分子抑制剂。用结晶紫测定法评估细胞密度/数量；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。用质谱法测定谷氨酰胺代谢物的相对定量。western blotting检测UPR、凋亡或自噬途径的信号分子。

结果：耐药细胞中MYC功能的增加与生存对谷氨酰胺和葡萄糖的依赖性增加相关。抑制MYC可降低耐药细胞的细胞生长和葡萄糖和谷氨酰胺的摄取。有趣的是，在缺乏葡萄糖的条件下，谷氨酰胺通过GRP78-IRE1α诱导细胞凋亡和坏死，阻止自噬，并触发未折叠蛋白反应（UPR），可能产生两种结果：（i）在大多数细胞中通过JNK激活抑制细胞生长，（ii）在少数细胞中通过剪接XBP1促进细胞生长。这些不同的效应在不同的信号连接处由MYC在耐药细胞中更有力地调节。

结论：内分泌耐药细胞过表达MYC，更能耐受葡萄糖缺乏期，并能在短期内使用谷氨酰胺维持足够的代谢以支持细胞存活。我们的研究结果揭示了MYC在通过UPR调节细胞命运方面的独特作用，并表明靶向谷氨酰胺代谢可能是治疗内分泌抵抗型乳腺癌的一种新策略。

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数字

图1
图1
抗雌激素抵抗的乳腺癌中MYC表达升高 在体外 和 体内 . A类与LCC1（雌激素非依赖性但有反应性；抗雌激素敏感）相比，LY2和LCC2（雌激素非敏感但有反应；抗雌激素抵抗）的基础MYC-荧光素酶活性高4.24倍（SE=0.10），LCC9（雌激素非相关且无反应；抗雌性激素抵抗）的活性高6.67倍（SE=0.09）；看见实验程序方差分析，第页 < 0.001; *第页 < 与LCC1细胞相比，指示细胞中MYC启动子激活为0.05。B类Western blot显示，与LCC1细胞相比，LCC9细胞中MYC蛋白的表达增加，而MAX蛋白水平没有变化；肌动蛋白被用作负荷控制。C类免疫组织化学（IHC）MYC染色显示，与LCC1异种移植物相比，LCC9中的蛋白质水平（棕色）增加；对于阴性对照，使用不含MYC抗体的抗体稀释液。D类，与敏感（或从头开始耐药）肿瘤。
图2
图2
MYC促进抗雌激素抵抗细胞的存活。 A类Western blot结果显示，与对照siRNA相比，使用MYC siRNA 48小时后LCC9细胞中的MYC降低。肌动蛋白是一种负荷对照。B类，LCC9细胞中MYC的定量显示，与对照siRNA相比，MYC siRNA转染细胞中的MYC减少了60%。C类，MYC siRNA与ICI在抑制LCC1细胞数量方面存在加性相互作用（RI=1.11），但在LCC9细胞中没有。六份代表性实验的相对细胞数（归一化为车辆控制）的平均值±SE。方差分析，第页< 0.001; *第页各细胞系的治疗组与对照组之间的差异<0.05，第页LCC1细胞与具有MYC siRNA+ICI的LCC9细胞相比<0.05。D类与LCC1细胞相比，LCC9细胞在48小时后对10058-F4的敏感性增加；巴，±东南。E类、10058-F4或ICI单独或组合48小时抑制LCC1中的细胞数量。在LCC9细胞中，RI=1.51，表明ICI和10058-F4之间存在适度的协同作用；方差分析，p<0.001*第页对于各自的细胞系，治疗与对照相比<0.05。^，第页ICI+10058-F4与10058-F4相比，<0.05。F类Western blot显示，与单独使用载体（V）或单独使用ICI（I）治疗（48 h）相比，使用10058-F4（MI：MYC抑制剂）或ICI+10058-F4（C：组合）时，MYC、MAX、BCL2减少，裂解CASP7增加。G公司、带有载体、ICI、10058-F4或ICI+10058-F4（组合）的LCC1和LCC9细胞中的Annexin V-FITC（凋亡）。方差分析，p<0.001*各细胞系的指示治疗组与载体对照组相比p<0.05。紫杉醇，细胞凋亡的阳性对照。H（H）点图显示细胞对膜联蛋白-V-FITC（x轴）和碘化丙啶（PI；y轴）呈阳性。
图3
图3
MYC抑制剂和抗雌激素联合使用可增加内分泌抵抗细胞的G1细胞周期阻滞。 A类,顶部、ICI（100 nM）、10058-F4（25μM）或联合用药显著增加了G1期阻滞细胞的百分比，降低了LCC1中S期细胞的百分比(第页 < 0.001).底部，显示了LCC1细胞中碘化丙啶（PI）的代表性细胞计数图。B类 ，顶部，只有ICI和10058-F4联合使用才能显著增加LCC9细胞G1期阻滞(第页 < 0.001).底部，显示了LCC9单元中PI的代表性单元计数图。图表表示以平均值±表示的数据东南方用于三个独立的实验。方差分析，第页 < 0.001; *第页 < 0.001用于指示治疗与车辆控制。
图4
图4
抗雌激素抵抗细胞对谷氨酰胺和葡萄糖的依赖性增加。 A类，谷氨酰胺代谢示意图：谷氨酰胺通过线粒体酶谷氨酰胺酶（GLS）转化为谷氨酸；反反应由谷氨酸-氨连接酶（GLUL）催化。谷氨酰胺是脯氨酸生物合成的重要底物。B-D公司UPLC-QqQLIT对谷氨酰胺、谷氨酸和脯氨酸的相对定量显示谷氨酸含量显著增加(第页 = 0.002）和脯氨酸水平(第页 = 0.032）与LCC1控制单元相比，在LCC9单元中；使用每个细胞系的六个生物复制品，将每个代谢物的水平标准化为每个样品中的总蛋白水平。E类，与LCC1细胞相比，在基础条件下，LCC9细胞的葡萄糖摄取量显著增加(第页 < 0.05). 使用Student’st吨测试F-G公司，使用siRNA抑制MYC显著降低(F类)谷氨酰胺(第页 < 0.05）和(G公司)葡萄糖摄取(第页 = 与LCC1电池相比，LCC9中为0.011）。方差分析，第页 < 0.001.H（H）siRNA抑制MYC可降低LCC9细胞中谷氨酰胺转运蛋白（ASCT2/SLC1A5）、谷氨酸转运蛋白（EAAT2/SLC1A2）和葡萄糖转运蛋白（GLUT1/SLC2A1）的蛋白水平。Western blot是三个独立实验的代表。
图5
图5
抗雌激素抵抗细胞中谷氨酰胺和葡萄糖代谢增加。 A-B公司，LCC9细胞对(A类)化合物-968，GLS/GAC抑制剂，以及(B类)STF-31是GLUT-1的抑制剂。条形代表以六倍形式进行的单个代表性实验的相对数（归一化为车辆控制）的平均值±SE。方差分析，第页 ≤ 0.001; *第页 < LCC9为0.05，LCC1为指示浓度。C类，用化合物-968（20μM）、STF-31（5μM）和ICI（100 nM）或指示的组合处理细胞48小时。条形代表以六倍形式进行的单个代表性实验的相对细胞数（归一化为车辆控制）的平均值±SE。方差分析，第页 < 0.001; *第页 < LCC9为0.05，LCC1为指示治疗。D类与LCC1细胞相比，LCC9细胞中用siRNA敲除GLS水平后24小时内细胞数量显著减少。方差分析，第页 = 0.03; *第页 ≤ 与LCC1 GLS siRNA相比，LCC9 GLS siRNA。E类Western blot显示两种细胞系中GLS水平降低；肌动蛋白被用作蛋白质负荷控制。F类,赖特用10058-F4（25μM）或载体处理LCC9细胞48 h；左边，用MYC或对照siRNA转染48小时。敲低MYC增加了GLS/GAC水平并降低了GLUL水平。G公司siRNA介导的MYC敲除显示LCC2和LY2细胞中GLS增加，GLUL水平降低。
图6
图6
MYC表达增加了对葡萄糖和谷氨酰胺缺乏的敏感性。 A-B公司，LCC1细胞中MYC的过度表达显著增加(第页 < 0.01）（A）和LCC9细胞中MYC的敲除（B）在缺乏葡萄糖和谷氨酰胺的情况下显著减少了细胞数量(第页 ≤ 0.001).( 首席财务官 )LCC1和LCC9细胞在完全（12 mM葡萄糖；2 mM谷氨酰胺）、不完全（无葡萄糖；无谷氨酰胺），仅葡萄糖（12 mC葡萄糖；无谷酰胺）和仅谷氨酰胺（2 mM谷酰胺；无葡萄糖）中培养72小时。通过将24小时、48小时和72小时的细胞数测量值归一化为0小时的细胞数量测量值来确定细胞生长速率的变化。在72小时时，LCC9细胞在完全培养基中的生长速度明显高于LCC1细胞。然而，与LCC1细胞相比，LCC9在不完全培养基中的生长速度显著降低。在纯葡萄糖培养基中（72小时），LCC1和LCC9细胞的生长没有增加。在仅有谷氨酰胺的培养基中，相对于LCC1细胞，LCC9细胞的细胞数量显著减少。虚线表示图表之间的比例变化。条形代表以六倍形式进行的单个代表性实验的相对数（归一化为车辆控制）的平均值±SE。G公司，LCC9细胞中MYC的敲除降低了对不完全培养基的敏感性，如B类在缺乏葡萄糖的条件下，在存在2 mM谷氨酰胺的情况下，也减少了对细胞数量的抑制。方差分析，第页 < 0.001;第页 ≤ LCC9-MYC siRNA与LCC9-对照siRNA在指定治疗中的差异为0.01。条形代表以六倍形式进行的单个代表性实验的相对数（归一化为车辆控制）的平均值±SE。
图7
图7
在葡萄糖缺乏的情况下，谷氨酰胺通过UPR诱导细胞凋亡并阻止自噬。 A类与LCC1细胞相比，经2或4 mM谷氨酰胺处理48小时后，LCC9细胞的凋亡水平显著升高。方差分析，第页 < 0.05; *第页 < LCC9为0.05，LCC1为指示治疗。B类自噬体相关蛋白LC3II（自噬小体形成或扩大的标记）和p62/SQSTM1（自噬体活性、货物降解的标记）的分析。在24和48小时时，在仅含谷氨酰胺的培养基（以及在无葡萄糖+无谷氨酰胺的条件下）中，LCC1和LCC9细胞的自噬体形成增加，但货物降解停止，而在仅含葡萄糖（或葡萄糖+谷氨酰胺）的培养基中则没有。C类在存在2或4 mM谷氨酰胺的情况下，LCC9细胞的MYC、MAX和LC3II水平增加，但SQSTM1/p62没有变化。D类，与不完全培养基中的LCC1细胞相比，LCC9中的总反应物种（RS）细胞水平显著升高（ANOVA，第页 < 0.001; *第页 < LCC9为0.05，LCC1为无葡萄糖+谷氨酰胺）。
图8
图8
缺乏葡萄糖条件下的谷氨酰胺激活UPR。 A类，细胞在70%的汇合处进行电镀。24小时后，将培养基改为0、2或4mM谷氨酰胺单独或在12mM葡萄糖存在下。Western blot分析显示LCC1中GRP78、IRE1a、磷酸化JNK、CHOP水平升高，BCL2水平降低(正确的)和LCC9(左边)细胞仅处于谷氨酰胺状态。当葡萄糖和谷氨酰胺同时存在时，MYC蛋白水平最高；当培养基中没有这些代谢物时，MYC是无法检测到的。MYC仅在谷氨酰胺存在下而非仅在葡萄糖存在下表达，与UPR蛋白表达增加相关。B类MYC敲除24小时后，再将培养基改变为葡萄糖+谷氨酰胺、仅葡萄糖、仅谷氨酰胺或无葡萄糖+无谷氨酰胺条件48小时。Western blots分析表明，MYC蛋白水平的降低与UPR蛋白IRE1α和磷酸化JNK（Thr183/Ty4185）、自噬体形成标记LC3II和自噬物降解标记p62/SQSTM1的增加相关。GRP78在葡萄糖+谷氨酰胺、仅葡萄糖和无葡萄糖+无谷氨酰胺的条件下也增加，但仅谷氨酰胺条件下GRP78的稳健表达不受MYC siRNA的影响。JNK的总水平没有改变。
图9
图9
在仅含谷氨酰胺的情况下，UPR可导致促生存和促死亡结果。转染靶向GRP78、IRE1α、XBP1和MYC的siRNA 24小时的效果；或使用小分子抑制剂（SP600125）抑制JNK在葡萄糖+谷氨酰胺或谷氨酰胺单体培养基中的生长。Western blot（48 h）；A-C公司，GRP78。D-F公司，IRE1α。G-I公司，JNK。J-L公司，XBP1。移动运营商，马来西亚。在LCC1和LCC9细胞系中，GRP78的抑制并没有进一步显著影响仅谷氨酰胺条件下的细胞数量，A类.两种细胞系在不同条件下的GRP78总蛋白的Western blot分析，B-C公司IRE1α的敲除，D-F公司和XBP1，J-L公司在两种细胞系中，在仅含谷氨酰胺的条件下显著增加了对细胞生长的抑制。然而，SP600125对JNK的抑制显著降低了仅在谷氨酰胺条件下对细胞生长的抑制，G-I公司此外，击倒MYC，移动运营商，显著降低了仅在谷氨酰胺条件下对细胞生长的抑制。总的来说，MYC可能促进了IRE1α-XBP1通路以促进仅谷氨酰胺条件下的细胞存活，以及IRE1β-磷酸化-JNK通路以促进这种情况下的细胞死亡。方差分析，第页 ≤ 0.001; *第页 < 在仅谷氨酰胺的条件下，用指示的siRNA转染（或用SP600125处理，对于JNK）的相应细胞系与对照siRNA（或单独的载体，对于JNK）相比为0.05。
图10
图10
MYC赋予抗雌激素抵抗细胞的代谢灵活性。 A类，与LCC9对照细胞相比，LCC9Gln细胞的细胞生长速度显著降低(第页 ≤ 0.001). 使用Student的t吨 测试。B类与对照组相比，LCC9Gln细胞中的MYC、MAX和GLUL蛋白水平降低，而GLS/GAC增加。C类，图解说明MYC在调节谷氨酰胺代谢中的作用(正确的; 基底；葡萄糖和谷氨酰胺）和仅在谷氨酰胺条件下(左边; 谷氨酰胺，但不含葡萄糖）。在正常情况下，MYC分别通过转运体ASCT2、EAAT2和GLUT1调节谷氨酰胺、谷氨酸和葡萄糖的摄取。在缺乏葡萄糖的情况下，谷氨酰胺代谢通过MYC调节的IRE1α-JNK-CHOP在短期内（72小时）触发UPR并诱导细胞死亡（诱导凋亡和阻止自噬），还通过IRE1β-XBP1（s）促进细胞存活；存活的细胞生长速度较慢(A类)>72小时。虚线表示存在本研究未提及的中间代谢物/蛋白质。
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