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.2014年10月9日；159(2):281-94.
doi:10.1016/j.cell.2014.09.019。

γCaMKII将Ca²/CaM穿梭至细胞核，触发CREB磷酸化和基因表达

欢妈 1, 瑞秋·D·格罗斯 2, 塞缪尔·科恩 三, 约翰·F·埃默里 三, 拳击李 三, 埃丝谢尔·霍特 4, 张国安 4, 托马斯·诺伊伯特 4, 钱其琛 5
附属公司

γCaMKII将Ca²/CaM穿梭至细胞核，触发CREB磷酸化和基因表达

欢妈等。 单元格. .

摘要

活性依赖性CREB磷酸化和基因表达对长期神经元可塑性至关重要。CaV1通道的局部信号传导触发了这些事件，但信息是如何传递到细胞核的仍不清楚。在这里，我们报道了一种调节细胞内远距离通讯的机制：一种将Ca（2+）/钙调蛋白从表面膜运输到细胞核的穿梭器。我们发现穿梭蛋白是γCaMKII，它在Thr287被βCaMKI磷酸化保护Ca（2+）/CaM信号，CaN触发其核转位。βCaMKII和CaN都与CaV1通道密切相关，支持其优势地位，而γCaMKIII则作为载体而非激酶发挥作用。到达细胞核后，Ca（2+）/CaM激活CaMKK及其底物CaMKIV，即CREB激酶。这一机制解决了长期以来关于CaM/CaMK依赖性信号传递到细胞核的困惑。CaV1、γCaMKII、βCaMKIL和CaN在多种神经精神疾病中的失调强调了该机制的重要性。

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数字

图1
图1。γCaMKII以活性依赖的方式转位到细胞核，对E-T偶联至关重要
（A） 以10 Hz刺激SCG神经元60 s或暴露于40 mM K+300 s，并用γCaMKII抗体染色。比例尺，10μm。（B） 10 Hz刺激60 s（实心棒）或暴露于40 mM K导致γCaMKII强度的核质比增加+300秒（开杆）。插入，记录由10 Hz场刺激诱发的动作电位。（C） 40 mM K触发γCaMKII易位+刺激被钙消除V（V）1种特异性阻断剂Nim（10μM）。40 mM K时（D1）mGFP-γCaMKII易位+刺激。亮场图像指示细胞形状，其他面板显示在指定时间点捕获的荧光图像（联合插孔格式）。（D2）40 mM K之前和期间的核mGFP强度+刺激（开始，t=0s，n=4）。（E） 用40 mM K刺激表达γCaMKII shRNA或非沉默对照shRNA的SCG神经元+持续10 s，并染色以检测pCREB（红色）。GFP（绿色）用于确认质粒的表达。pCREB反应通过γCaMKII敲低而被阻止，并通过过表达shRNA抗性γCaMKII构建体γCaMKII而被挽救R（右）（详见补充图1H–J）。（F）c-fos公司SCG神经元中的蛋白质水平如（E）中所述，并用40 mM K刺激+300秒，然后在正常培养基中培养40分钟，以留出时间进行基因表达。γCaMKII敲除阻止c-fos公司被过度表达的γCaMKII拯救R（右）（另请参见补充图1M）。在所有图中，*表示p<0.001，由学生的t吨-测试。数据表示为平均+/-SEM。另请参见图S1。
图2
图2。γCaMKII/CaM易位驱动活性相关的核pCaMKII再分配
（A） 以10 Hz或40 mM K刺激SCG神经元60 s+持续300 s，并进行磷酸化-Thr-286/287-CaMKII（pCaMKII）染色。比例尺，10μm。（B） 核与细胞质pCaMKII强度比值增加的汇总数据。（C，E）pCaMKII和γCaMKIL（R=0.8）或CaM和γCaM KII（R=0.7）之间核质强度比的单细胞相关性，以响应40 mM K+，300 s.（D，F）SCG神经元表达γCaMKII shRNA或非沉默控制shRNA，如（C）所示。γCaMKII敲除可防止pCaMKI和CaM的核质比增加。（G） 内源性γCaMKII被敲除，shRNA-resistantγCaMJIIR（右）或γCaMKIIR（右）T287A在SCG神经元中过度表达。在如（C）中所示的刺激下，γCaMKIIR（右）和γCaMKIIR（右）T287A转位到细胞核；然而，只有γCaMKIIR（右），不是γCaMKIIR（右）T287A，挽救了CaM易位。“+”和“−”分别表示显著或不显著的变化（详见补充图2 I、J）。另见图S2。
图3
图3。CaN对SCG和皮层神经元的γCaMKII/CaM移位和pCREB反应是必要的
40 mM K刺激（A，B）SCG神经元+在没有或存在钙调神经磷酸酶特异性抑制剂环孢菌素A（CsA，50 nm）的情况下持续300 s。暴露于CsA可防止γCaMKII（A）和CaM（B）的移位。（C） 40 mM K时的pCREB响应+CsA可阻止刺激10s。（D，E）用5 mM K模拟刺激培养的皮层神经元+或用40 mM K刺激+60 s，并染色γCaMKII或CaM（与αCaMKI抗体结合以标记兴奋性神经元）。钙V（V）1抑制剂Nim（10μm）或CaN抑制剂CsA（50 nm）阻止γCaMKII和CaM的移位。（F） 如（C）中所述处理的皮层神经元，再加上特定MEK抑制剂PD98059（50μm），进行pCREB染色。CsA抑制pCREB反应。（G） 从培养的皮层神经元中分离出细胞核，并进行Western blot分析以探测γCaMKII。40毫微米+刺激完整细胞可诱导核γCaMKII增加，Nim（N=7）可阻止这种增加。层粘连蛋白B是一种核标记物。（H） 用γCaMKII shRNA或非沉默对照shRNA转染的皮层神经元，如（D）所示刺激并染色CaM。γCaMKII基因敲除阻止了CaM易位。（一） 皮质神经元表达γCaMKII shRNA或非沉默对照shRNA。γCaMJII敲除可阻止刺激性pCREB反应。另请参见图S3。
图4
图4。γCAMKII在细胞表面附近被CaN去磷酸化以驱动核移位
（A） 磷酸肽RKS（Phospho）SSSVHLM（氧化）EPQTTVHNATDGIK的五倍带电离子（m/z 564.4773）的全扫描质谱A′CaMKII公司。（B） 磷酸肽RKS（磷酸）SSSVHLM（氧化）EPQTTVHNATDGIK的串联质谱（MS/MS）。利用高能碰撞诱导离解对五重带电离子（m/z 564.4773）进行了MS/MS分析。根据光谱注释所示的匹配的b-和y-离子序列，自信地确定了肽序列和磷酸化位点。注意，除b2离子外，所有b离子都对应于磷酸中性损失后的碎片。柱状图（插入）表明，在添加钙调神经磷酸酶和CaM 30分钟后，S334的磷酸化状态（以橙色方框标记）减弱至对照组的约50%。N=3个实验，每个实验重复三次。（C） 表达γ的SCG神经元A′CaMKII或γA′用40mM K刺激的CaMKII S334E+持续300秒；γA′CaMKII但不是γA′刺激后CaMKII S334E易位到细胞核。γ点A′绿色箭头标记的刺激后，细胞表面形成CaMKII S334E。比例尺，10μm。插入，S334E点突变的位置，只是核定位序列（NLS）的羧基。（D，E）SCG神经元过表达γ的代表性图像A′CaMKII S334E或γA′CaMKII，用40 mM K刺激+60秒。箭头，γA′CaMKII S334E点状与CaN（D）或γ共定位A′在存在CaN抑制剂CsA的情况下，CaMKII点状物与CaN共定位（下面板）（E）。无γA′未使用CaN抑制剂形成CAMKII点状物（上面板）（E）。比例尺，5μm。另请参见图S4。
图5
图5。βCaMKII对γCaMKIL的磷酸化：γCaMJII易位不需要，但需要CaM易位和CREB磷酸化
（A，B）箭头，内源性βCaMKII（A）或过表达γA′CaMKII S334E（B）与Ca点共定位V（V）40 mM K时为1.3个通道+刺激60s。比例尺，1μm。（C） 用40 mM K刺激表达βCaMKII shRNA或非沉默对照shRNA的SCG神经元+300 s，pCaMKII染色（第一排），γCaMKIL和CaM共染色（第二排和第三排），pCREB染色（第四排）。比例尺，10μm。βCaMKII敲除阻止了核pCaMKIL水平（−）、CaM易位（−。“+”和“−”分别表示显著或不显著的变化（详见补充图5A–D）。（D–E）HA-标记γA′浓缩CaMKII K43R并用HA抗体包被的琼脂糖微球固定。暴露于25μM ATP 10 s后，无论是否存在44μg/mlβCaMKII，1mM CaCl2和1μM CaM，固定化γA′从珠子中洗脱CaMKII K43R并收集用于蛋白质印迹分析。γ的磷酸化状态和量A′通过针对pCaMKII和γCaMKIL（D）的特异性抗体检测CaMKI K43R。使用βCaMKII的特异性抗体来确认pCaMKIL不是由βCaMKII在珠子上的积聚引起的。（E） βCaMKII（n=7）存在时，pCaMKII:γCaMKIII的比率显著增加，但仅当CaM和Ca同时存在时2+存在（n＝4）。（F-H）箭头表示内源性βCAMKII（F）和过度表达γA′CaMKII S334E（G），但不是γCaMKIL（H），在40 mM K上与pCaMKI点共定位+刺激60s。比例尺，1μm。另请参见图S5。
图6
图6。核CaMK级联的激活以及γCaMKII和CaM在驱动CREB磷酸化中的不同作用
（A） 40 mM K刺激SCG神经元+在没有或存在CaN抑制剂CsA（50 nm）的情况下持续10 s。CsA抑制核pCaMKIV水平的增加。（B） 用40mM K刺激表达γCaMKII shRNA、βCaMKII shRNA或非沉默对照shRNA的SCG神经元+持续10 s，并对pCaMKIV进行染色。γCaMKII或βCaMKIL的敲除阻止了CaMKIV的激活。（C） 显示游离Ca的模式2+/γCaMKII传递的CaM（表示CaMK*）激活由CaMKK和CaMKIV组成的CaMK级联。通过使用不同的抑制剂（CsA、STO-609）或shRNA（针对βCaMKII、γCaMKIII或CaMKIV）预防关键步骤，用红色表示；矩形显示监控变量（详见补充图6）。表达γCaMKII shRNA的（D–F）SCG神经元A′CaMKII公司R（右）或γA′CaMKII公司R（右）用40 mM K刺激K43R+持续300秒（D，E）或10秒（F）。两者都是γA′CaMKII公司R（右）和γA′CaMKII公司R（右）K43R可在刺激（D）时转位到细胞核，并支持CaM转位（E）和pCREB反应（F）。（G） 表达γCaMKII shRNA和γCaMJII shRNA耐药γ的SCG神经元A′CaMKII公司R（右）A303R或γA′CaMKII公司R（右）T287A如（F）所示受到刺激。都不是γA′CaMKII公司R（右）A303R或γA′CaMKII公司R（右）T287A挽救了pCREB响应。另请参见图S6。
图7
图7。钙的核传递2+/CaM足以驱动CREB磷酸化
（A） 测试钙的充分性2+/CaM具有核定位的笼状CaM。（B） HA标记的NLS-Nrgn或NLS-Nergn S36D成功靶向细胞核。比例尺，10μm。（C） 40 mM K刺激表达γCaMKII shRNA或非沉默控制shRNA的SCG神经元+持续10秒。NLS-Nrgn而不是NLS-Nrgn S36D能够恢复pCREB反应，分别与携带CaM以在核Ca释放的能力或不能力一致2+高程。在基础条件下，过度表达NLS-Nrgn或NLS-Nergn S36D不会影响pCREB水平（详见补充图7A、B）。另请参见图S7。
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