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.2014年9月8日5:4692。
doi:10.1038/ncomms5692。

小鼠Wdfy3的缺失改变了大脑皮层神经发生，反映了自闭症病理学的各个方面

洛丽·奥罗斯科 1, 亚当·罗斯 1, Staci L Cates公司 1, 肖恩·斯科特 1, 丹尼斯·吴 2, Jiho Sohn先生 三, David高兴 4, Samuel J Pleasure公司 5, 伊安尼斯·阿达莫普洛斯 2, Konstantinos S Zarbalis公司 1
附属公司

小鼠Wdfy3的缺失改变了大脑皮层神经发生，反映了自闭症病理学的各个方面

洛丽·奥罗斯科等。 国家通讯社. .

摘要

自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂且异质的发育障碍，影响着世界范围内越来越多的儿童。ASD的多样表现和复杂的主要遗传病因对确定统一的神经病理学特征提出了重大挑战。在这里，我们描述了携带Wdfy3基因有害等位基因的小鼠的神经发育缺陷，最近被认为是ASD的病因。Wdfy3缺失导致大脑皮层区域性增大，类似于自闭症谱系中许多儿童的早期大脑过度生长。此外，受影响的小鼠突变体表现出皮层投射神经元的迁移缺陷，这是公认的癫痫病因，与自闭症显著相关。我们对受影响小鼠突变体的分析确定了Wdfy3在调节发育中大脑的神经祖细胞分裂和神经迁移中的重要作用。此外，Wdfy3对大脑扩张和功能组织至关重要，而其功能丧失会导致ASD特有的病理变化。

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数字

图1
图1。的位置映射断开的(圆盘)纯合子突变体的等位基因与前脑过度生长
(一)该图显示了5号染色体上标记D5Mit156和D5Mit275之间的基因组间隔圆盘绘制了突变图。显示了本研究中所有外显子测序间隔内的所有蛋白编码基因。(b条)野生型和光盘/光盘PCR扩增子显示了唯一识别的编码变体的位置（T到A，无义）。(c（c）)示意图显示了小鼠Wdfy3蛋白的已识别结构域，其具有圆盘3046位的等位基因显示。图中给出了每个域的第一个剩余。(d日)全脑背视图显示纯合子的形态异常圆盘星号表示的变种。(e（电子）)E15.5 WT和纯合子前脑的Nissl染色冠状半切面圆盘突变体说明了受影响突变体中存在的畸形。绿线表示皮质长度和厚度的测量值（D，背部；ML，内侧；L，侧面），而橙色区域表示皮质大小的测量值。(（f）)大脑内侧外侧皮质的特写显示光盘/光盘突变体。(克)个体皮层空间参数的量化证实，长度和整体尺寸显著增加，但基底外侧部径向变薄。学生的所有分析t吨-测试中，任一基因型的n均在条形图中表示，该条形图表示平均值和标准平均误差（SEM）。星号表示计算出的p值发生了显著变化。丘脑前核；Cb，小脑；CP，皮质板；Cx，大脑皮层；HC，海马；IZ，中间带；LGE，外侧神经节隆起；左心室，侧心室；MZ，边缘带；SM，髓质纹；SVZ，室下区；Th，丘脑；VZ，心室区。比例尺输入e（电子）为500μm和in（f）100微米。
图2
图2。纯合子中神经祖细胞增殖和神经发生发生改变圆盘/圆盘胚胎
(一)E12.5和E14.5新皮质神经上皮中Pax6表达的免疫荧光分析。E12.5大脑中的黄色虚线勾勒出Pax6的测量区域+心室区（VZ）。E14.5处的红线突出显示了VZ的横向变薄。(b条)Pax6的量化+VZ显示光盘/光盘任一阶段的突变体。相反，Pax6的密度+细胞在光盘/光盘胚胎（c，d日). (e（电子）-小时)Tbr2的免疫荧光面积和密度分析+中间祖细胞在这两个结构域中都显著减少。(我,j个)24小时EdU脉冲相分析显示神经元总输出量减少+/Ki67号机组−室下区基底细胞（SVZ）]，但已退出细胞周期的细胞的Q分数增加。(k个)中外侧皮质的代表性冠状切片显示了时间移位双胸腺嘧啶标记实验的结果以及E13.5处EdU-、BrdU-和Ki67标记细胞的分布。(我)S相长度的量化（TS公司)和细胞周期总长度（TC类)确定显著减少光盘/光盘与WT相关的突变体。Student’s的所有统计分析t吨-测试。条形图显示平均值和SEM，表示任一基因型的n，并计算出显著变化的p值（星号）。CP，皮质板；Cx，大脑皮层；IZ，中间带；左心室，侧心室；Th，丘脑。比例尺输入一为200μm，英寸c（c）10微米，英寸e（电子）100微米，英寸克20微米，英寸我100μm和50μm，以及英寸k个20微米。
图3
图3。Wdfy3在神经发生过程中在放射状神经胶质分裂的一个子集中上调
(一)对位于E14.5 WT大脑皮层脑室的皮层神经前体细胞中Wdfy3的免疫荧光检测表明，分裂细胞在有丝分裂的所有阶段都处于上调状态。(b条)Wdfy3与放射状胶质细胞标记物Pax6和中间祖细胞标记物Tbr2共表达分析。Wdfy3公司+细胞仅呈现分裂祖细胞的子集（红色箭头），并被Wdfy3包围−有丝分裂细胞(c（c）)Wdfy3与有丝分裂标记pHH3的共表达分析证实，只有一小部分有丝分裂细胞是Wdfy3+. (d日)Wdfy3的量化+/pHH3型+E12.5和E14.5处的单元格显示光盘/光盘突变体。学生分析t吨-测试。条形图显示了平均值和SEM，图中显示了分析的胚胎数量（n）和计算的p值。比例尺输入一为10μm，英寸b条20μm和英寸c（c）40微米。
图4
图4。纯合子圆盘突变体表现出神经元迁移缺陷
皮质分层标记物Tbr1（第VI层）和Ctip2（第V层）的免疫荧光分析显示光盘/光盘突变体在P0。箭头指向突变体中任一标记的移位细胞的单个局部异位。星号突出显示较小规模的叠层异常。所有显示的截面均位于体感皮层的冠状面。比例尺为200μm。
图5
图5。Wdfy3公司lacZ/lacZ通过基因靶向产生的小鼠表现出比其他小鼠更严重的神经发育缺陷Wdfy3公司光盘/光盘老鼠
(一)通过WT、杂合子和纯合子前脑的Nissl染色冠状半切面lacZ公司新生幼崽说明了受影响的突变体中存在的畸形。黄色虚线表示WT中从皮质-应变边界到心室顶点的皮质长度。红色虚线表示lacZ公司突变体。(b条)侧位和背位皮质节段的特写显示lacZ公司突变体。(c（c）)显示统计分析结果（平均值和SEM）的条形图（学生t吨-test）用于比较形态学参数。条形图中显示了分析幼鼠的数量（n）和计算出的显著变化的p值（星号）。如图1e所示进行测量。(d日)β-半乳糖苷酶（β-gal）的表达分析Wdfy3公司lacZ公司老鼠标签Wdfy3+细胞及其后代，并在E11.5处证实分散的β-gal+VZ、边缘区（MZ）和脑膜（Me）中的细胞。(e（电子）)P0背内侧体感皮层冠状切片标记β-gal表达和NeuN和GFAP免疫组化证实Wdfy3+祖细胞有助于许多神经元和一些胶质细胞（绿色箭头），但并非所有NeuN+或GFAP+单元格（红色箭头）。比例尺输入一为500μm，英寸b条200微米，英寸d日50μm和英寸e（电子）20微米。
图6
图6。Wdfy3公司lacZ/lacZ小鼠的特点是广泛的局灶性皮层发育不良，影响大多数皮层区域
(一)脾后皮质的Nissl染色冠状切片显示纯合子的局灶性皮质发育不良lacZ公司突变体，破坏所有皮层并侵入边缘区（MZ，箭头）。(b条)皮质层标记物Tbr1（第VI层）和Ctip2（第V层）的免疫荧光揭示了纯合子的体感和运动皮质的局灶性异常lacZ公司P0处的突变（箭头）。星号通过混合Ctip2突出异常层的形成+带有Tbr1的神经元+大脑皮层VI.Cx层神经元；IZ/WM，中间带白色物质；ML中线；MZ，边缘带；VZ/SVZ心室区/心室下区。比例尺为100μm。
图7
图7。大鼠自噬流量无变化光盘/光盘胚胎
(一)WT和P62裂解物上LC3和P62的Western blot分析圆盘/圆盘发育阶段E12.5和E15.5的突变体大脑在基因型之间的表达水平没有变化。(b条)LC3II/I比率和P62水平的量化证实了这两种基因型的表达水平相等。(c（c）)WT和WT原代神经元培养中P62点的免疫荧光分析光盘/光盘胚胎在基因型之间没有显著差异，因为量化结果是(d日)演示。(e（电子）)泛素化蛋白的Western blot分析显示基因型之间没有差异(（f）)演示。学生的所有分析t吨-测试。条形图中显示的任一基因型的样本数量（n），显示平均值和SEM。比例尺20μm。
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