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.2014年8月26日；7（340）:ra81。
doi:10.1126/scisional.2005334。

信号素3A激活鸟苷三磷酸酶Rab5，促进生长锥塌陷并组织胼胝体轴突投射

吴孔炎 1, 苗河 1, 琼-琼侯 1, 爱丽生 1, 雷远（Lei Yuan） 1, 刘飞 1, 刘文文 2, 李广普 三, 邢玉江 2, 郑戈洛 4
附属公司

信号素3A激活鸟苷三磷酸酶Rab5，促进生长锥塌陷并组织胼胝体轴突投射

吴孔炎等。 科学信号. .

摘要

轴突引导（寻路）在发育过程中连接大脑，并受各种吸引和排斥线索的调节。信号素3A（Sema3A）是一种排斥性线索，导致轴突生长锥细胞的崩溃。在哺乳动物前脑中，胼胝体是两半球之间传递信息流的主要连合，对侧轴突汇聚成定义明确的束。我们发现，啮齿动物第二层和第三层（L2/3）皮层神经元对Sema3A的反应中胼胝体轴突投射的模式是由Rab5的激活介导的，Rab5是一种小的鸟苷三磷酸酶（GTPase），通过膜融合蛋白Rabaptin-5和Rab5鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）介导内吞作用拉贝克斯-5。Rabaptin-5在Sema3A受体复合物中直接与Plexin-A1结合[由Plexin-A1和neuropilin 1（NP1）形成的专性异二聚体]；Sema3A增强了培养神经元的这种相互作用。Rabaptin-5桥接Rab5和Plexin-A1之间的相互作用。Sema3A刺激了胼胝体轴突生长锥细胞表面的内吞作用。宫内电穿孔以减少Rab5或Rabaptin-5损伤大鼠轴突束或导致L2/3胼胝体投射物靶向错误。Rabaptin-5或Rab5的过表达挽救了在表达显性阴性Plexin-A1的大鼠或NP1缺陷小鼠中由Sema3A-Lexin-A1信号丢失引起的胼胝体轴突束化缺陷或胼胝体轴突靶向错误。因此，我们的研究结果表明，Rab5、其效应器Rabaptin-5及其调节器Rabex-5在大脑发育期间介导Sema3A诱导的轴突导向。

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数字

图1
图1。Rabaptin-5与Plexin-A1相互作用
(A类)小鼠Plexin-A1蛋白的示意图，包括Sema、PSI（Plexin-semaphorin integrin）和IPT[免疫球蛋白（Ig）样、Plexin、转录因子]胞外结构域以及跨膜和胞内结构域。(B类)出生后第5天（P5）大鼠上皮层匀浆中Rabaptin-5与Plexin-A1共免疫沉淀的免疫印迹。印迹是三个实验的代表。Ctrl，control。(C类)通过GST–cytoPlexin-A1或GST珠降低HEK293细胞中表达的Rabaptin-5。Blot是三个实验的代表。(D类)通过GST–cytoPlexin-A1或GST珠拉动纯化的His-tagged Rabaptin-5。印迹是五个实验的代表。(电子和F类)HEK293细胞裂解液中Rabaptin-5（E）或HA（F）免疫沉淀前后的cytoPlexin-A1（通过HA标签）、Rabaptin-5和Rab5b免疫印迹。印迹是五个实验的代表。(G公司)在用Sema3A（300 ng/ml）处理指定时间的培养皮层神经元中，对Rabaptin-5进行免疫沉淀后，对Rapaptin-5和Plexin-A1进行免疫印迹。印迹是三个实验的代表。(H（H）和我)在转染GFP的培养L2/3皮层神经元中，未经或经Sema3A治疗（300 ng/ml，5 min）的内源性Rab5和Plexin-A1共定位的免疫染色分析。数据是来自三个实验的平均值±SEM（29个神经元用于对照，34个神经元用于Sema3A）***P（P）<0.001，学生t吨测试。比例尺，5μm。
图2
图2。Sema3A信号激活Rab5
(A类和B类)通过使用GST-R5BD下拉测定指定时间内用Sema3A（300 ng/ml）处理的3个DIV（体外天数）L2/3神经元中Rab5-GTP的丰度。数据是来自三个实验的Rab5-GTP和总Rab5比率的平均值±SEM，并将其归一化为对照*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，采用Tukey HSD（诚实显著差异）事后检验进行单因素方差分析（方差分析）。a.u.，任意单位。(C类)免疫印迹法检测培养皮层神经元中siRabaptin-5的效率，以内源性b-actin和车辆编码GFP作为负荷控制。(D类和电子)Satb2轴突生长锥中GST-R5BD标记的Rab5-GTP+转染干扰（对照）或指示siRNA的L2/3神经元，用载体或Sema3A处理（300 ng/ml，15分钟）。使用矢量编码GFP标记生长锥的形态和体积。数据是来自三个实验中至少23个神经元的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，使用Bonferroni校正进行事后比较的双向方差分析。比例尺，10μm。(F类)从P5大鼠上层皮质匀浆中免疫沉淀Rabaptin-5后的Rabaptin-5和Rabex-5免疫印迹。斑点是五个实验的代表。(G公司和H（H）)具有指定基因型的P30小鼠大脑皮层或海马中Rab5-GTP丰度的免疫印迹。数据是三个实验的平均值±SEM***P（P）<0.001，Tukey HSD事后测试的单向方差分析。
图3
图3。Rab5b在生长锥动力学中的作用
(A类和B类)免疫印迹法检测指示的siRNA对HEK293细胞（A）或培养皮层神经元（B）中内源性Rab5b裂解物中异位HA-Rab5b丰度的影响，并以编码相应扰码序列的载体作为对照。印迹是三个实验的代表。(C类到电子)Satb2轴突生长锥的分析+用含有或不含Sema3A的指定载体转染L2/3神经元（300 ng/ml，15分钟）。F-actin由Alexa Fluor 555指骨样蛋白（C）标记。数据是三个实验中坍塌生长锥（D）或归一化生长锥面积（E）百分比的平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，双向方差分析，带Bonferroni校正事后检验。比例尺，10μm。(F类到H（H）)Satb2轴突生长锥的分析+用指定结构转染L2/3神经元。数据是三个实验中无明显生长锥（G）或标准化生长锥面积（H）的轴突百分比的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，Tukey HSD事后测试的单向方差分析。比例尺，10μm。
图4
图4。Rab5沉默阻碍Sema3A诱导的膜内吞
(A类和C类)将转染有指示质粒的培养L2/3神经元与Alexa标记的右旋糖酐（A）或FM4-64（C）在Sema3A存在或不存在的情况下孵育15分钟。将载体质粒（A）或者pSUPER编码的加扰siRNA（C）设为对照。图片显示Sema3A治疗后的内吞染料（红色）。比例尺，10μm。(B类和D类)右旋糖酐（B）或FM4-64（D）摄取定量。染料强度与GFP的比值代表内吞活性。数据为三个实验的平均值±SEM，归一化为对照组*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，双向方差分析，带Bonferroni校正事后检验。
图5
图5。Sema3A通过Rab5抑制轴突生长
(A类)E17.5大鼠脑片Sema3A和Smi312染色，DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色。NCx，新皮质；WM，白质；心室区/室下区；SCS，副吊索；IGG，软骨细胞诱导物。比例尺，500μm。(B类和C类)Sema3A或对照蛋白条带上转染Rab5b siRNA（#503）或干扰siRNA（对照）的DIV3 L2/3神经元的轴突模式。图像代表每组至少127个神经元（B）。数据为三个实验的平均值±SEM，即细胞体和轴突限制在两条条纹之间相同间隙内的神经元百分比***P（P）<0.001，双向方差分析，带Bonferroni校正事后检验。比例尺，60μm。(D类)双室微流体培养系统插图，放大区域显示两室之间的微通道。(电子到G公司)转染Rab5b siRNA（#503）或搅乱siRNA到远端小室的L2/3神经元轴突生长，DIV4中未添加或添加Sema3A（300 ng/ml）。图中显示了Sema3A应用48小时后的代表性结果（E）、穿过通道的轴突百分比（F）和远端室中轴突的平均长度（G）。数据是三个实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，双向方差分析，带Bonferroni校正事后检验。比例尺，100μm。
图6
图6。Rab5对体内轴突束化至关重要
(A类和B类)P7大鼠初级躯体感觉皮层（S1）和二级躯体感觉皮质（S2）的胼胝体轴突模式在E15.5处用指示质粒（dnRab5b或Rab5b、siRab5b#503或siRab5 b#503+siRab2#和siRab4c#2；图S7，A至C显示了每种的特异性和效率）以及pCAG-IRES-EGFP，DAPI显示皮质层和胼胝体标志。方框显示轴突束位于中线和对侧，距离中线1400μm，白色虚线标记白质的背腹（DV）表面，白色短线表示电穿孔轴突束的边界。比例尺，1000μm。(C类到F类)量化各组电穿孔轴突束宽度与中线（C和E）或对侧（D和F）整个白质宽度之比，用电穿孔S1和S2区域的GFP强度和对照组的GFP密度标准化，设为1。数据为每组至少三只大鼠的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，Tukey HSD事后检验的单因素方差分析。(G公司)Rab5b减少对胼胝体轴突影响的典型图像。箭头表示轴突侵入胼胝体下方的腹侧实质。比例尺，1000μm。
图7
图7。Rabaptin-5在体内轴突束化中的作用
(A类和B类)P7大鼠S1和S2的胼胝体轴突模式在E15.5处电穿孔，显示质粒和pCAG-IRES-EGFP，DAPI显示皮质层和胼胝体标记。轴突束和白质的边界分别用短线和虚线表示。比例尺，1000μm。(C类到F类)量化各组电穿孔轴突束宽度与中线（C和E）和对侧（D和F）白质宽度之比，并与S1和S2区域的GFP强度标准化。数据为每组至少三只大鼠的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，采用Tukey HSD事后检验的单向方差分析（C和D）和采用Bonferroni校正事后检验的双向方差分析（E和F）。
图8
图8。Rab5防止NP1敲除引起的轴突脱纤维
(A类)第5.5页NP1号机组飞行/飞行用载体ubiqutin-Cre-2A-GFP或ubiqutin-Cre-2A-GFP+Rab5b以及pCAG-IRES-EGFP电穿孔小鼠胚胎。在P7分析胼胝体轴突，DAPI和Sema3A信号显示胼胝体标记。方框区域显示中线（a1、a3、a5）和对侧（a2、a4、a6）的轴突束，白色短线和虚线分别表示电穿孔轴突束和白质的边界。比例尺，1000μm。(B类和C类)量化各组胼胝体中线（B）和对侧（C）电穿孔轴突束宽度与白质宽度之比，并用S1和S2区GFP强度标准化。数据为每组至少三只小鼠的平均值±SEM***P（P）<0.001，双向方差分析，带Bonferroni校正事后检验。
图9
图9。抑制Rab5导致对侧胼胝体轴突轨迹定位错误
(A类到C类)用载体、Rab5b或dnRab5b质粒以及pCAG-IRES-EGFP电穿孔E15.5小鼠胚胎。P14小白鼠大脑短角近似水平−冠状切片1.58mm，Sema3A和DAPI染色，标记皮质层和胼胝体。（A）中的方框区域分别表示对侧S1和S2（B）以及RSA和RSG（C）区域。RSA，脾后无颗粒皮质；脾后颗粒皮质。标尺，1000μm（A）和500μm（B和C）。(D类)胼胝体轴突投射指数（API）的量化，计算公式如下：（指示区域的GFP强度/对侧半球总轴突束的GFP密度）×100。数据为每组至少四只小鼠的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，Tukey HSD事后测试的单因素方差分析。
图10
图10。Rab5的强制表达克服了由NP1号机组淘汰赛
(A类到C类)图15.5NP1号机组飞行/飞行用载体ubiqutin-Cre-2A-GFP或ubiqutin-Cre-2A-GFP+Rab5b以及pCAG-IRES-EGFP电穿孔小鼠胚胎。对P14小鼠大脑进行冠状切片，并对Sema3A和DAPI进行染色，以标记皮层和胼胝体。（A）中的方框区域分别表示对侧S1和S2（B）以及RSA和RSG（C）区域。标尺，1000μm（A）和500μm（B和C）。(D类)API的量化。数据为每组至少三只小鼠的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，双向方差分析，带Bonferroni校正事后检验。
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