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.2014年12月；28(12):5172-83.
doi:10.1096/fj.14-253229。 Epub 2014年8月25日。

脂联素调节活化肝星状细胞中的局灶黏附分解：逆转肝纤维化的意义

普拉迪普·库马尔 1, 特克拉·史密斯 1, 哈利杜·拉赫曼 1, 杰米·梅尔斯 1, 娜塔莉·索恩 1, Neeraj K Saxena公司 2, 弗兰克·阿纳尼亚 三
附属公司

脂联素调节活化肝星状细胞中的局灶黏附分解：逆转肝纤维化的意义

普拉迪普·库马尔等。 美国财务会计准则委员会J. 2014年12月.

摘要

先前的证据表明，脂联素在抑制肝纤维化方面具有抗纤维化活性。然而，治疗策略受到脂联素四级结构和循环中有效浓度的限制。在这里，我们假设了一种新的分子机制，脂联素通过靶向黏着斑激酶（FAK）活性并破坏成纤维反应的关键特征。将脂联素缺乏（Ad（-/-））小鼠和野生型同窝小鼠暴露于盐水或四氯化碳（CCl4）中6周。CCl4灌胃小鼠也注射减毒腺病毒脂联素（Ad-Adn）或Ad-LacZ 2周。用脂联素或不用脂联素处理肝星状细胞以阐明信号转导机制。体内释放Ad-Adn可显著减弱CCl4诱导的关键整合素蛋白和HSC活化标记物的表达：αv、β3、β1、α2（I）胶原和α-平滑肌肌动蛋白。肝组织的共聚焦实验表明，脂联素输送也抑制激活的HSC中的vinculin和p-FAK活性。在体外，脂联素诱导FAK去磷酸化，通过与活化酪氨酸磷酸酶Shp2的物理结合介导。相反，siRNA敲低Shp2可显著减弱脂联素诱导的FAK失活，并且在脂联素和si-FAK存在的情况下，TIMP1和α2（I）胶原的表达被消除。最后，我们记录了脂联素或具有脂联素特性的合成肽ADP355抑制合成基质中的p-FAK，刚度测量值为9和15 kPa，通过免疫荧光成像和定量评估。体内和体外数据表明，既然有小的脂联素样肽可用，HSC中黏附复合体的分解对肝纤维化治疗至关重要。

关键词：应用程序1；FAK（传真）；Shp2；肌成纤维细胞；长春花碱。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者感谢Rebecca Wells博士及其实验室工作人员（美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学）在实验结果方面的智慧投入，以及他们在帮助玻璃盖玻片实验方面的帮助。

数字

图1。
图1。
脂联素减弱CCl4-诱导性肝纤维化体内试验。A类)CCl灌胃小鼠肝切片胶原的天狼星红染色4然后是Ad-Adn交付通过尾静脉。B类)对染色进行量化，并进行密度分析（原始视图×40）。C类)所有8组小鼠的血清天冬氨酸转氨酶（AST）水平。D类)qRT-PCR检测肝脏整合素αv、β3、β1、vinculin、α-SMA和α2（I）胶原mRNA的表达。E类)WT和Ad肝组织裂解产物的代表性Western blot分析−/−老鼠*P（P）< 0.05.
图2。
图2。
脂联素调节FA组件体内试验。A类)WT和Ad肝切片的结蛋白和管状蛋白染色−/−老鼠。共聚焦图像显示CCl肝切片中的长春花蛋白和结蛋白染色增加4-治疗小鼠。Ad-LacZ不能降低染色强度；然而，CCl中的Ad-Adn4-灌胃小鼠显著减弱vinculin和desmin染色。B类)WT和Ad肝切片中p-FAK和结蛋白的共焦图像−/−老鼠。在CCl中4-灌胃小鼠p-FAK和结蛋白染色增强，但在Ad-Adn抢救后，染色强度显著降低。比例尺=50μm(n个≥4只小鼠/队列）。
图3。
图3。
脂联素通过抑制活化大鼠HSC中长春花蛋白的表达和FAK的去磷酸化来破坏FA的组装体外试验。A类)用脂联素处理活化的HSC，然后进行免疫荧光染色（绿色，管状蛋白；红色，F-actin）。控制，电镀初级激活HSC；瘦素，阳性对照。比例尺=20μm。B类)用脂联素处理的细胞中的抗FAK蛋白IP后的vinculin的Western blot（WB）。C类)用密度分析法对脂联素处理的活化HSC进行蛋白质印迹，证明FAK的酪氨酸磷酸化降低。D类)脂联素诱导的Tyr542的Shp2磷酸化。E类)对脂联素处理的活化HSC进行IP检测FAK，然后用抗p-Shp2和抗FAK进行Western blot分析，证明FAK和Shp2之间存在物理联系。F类)利用抗Shp2（si-Shp2）的干扰siRNA或混合siRNA对HSC进行脂质体转染。G公司)尽管存在脂联素，siShp2敲除仍恢复了FAK磷酸化。H（H）)通过qRT-PCR和Western blot分析TIMP1和α2（I）胶原的mRNA和蛋白表达。用打乱的siRNA或siFAK转染原代大鼠HSC，然后提取总RNA，并定量mRNA表达。磷酸化物种带强度的密度分析与总强度有关，以相对密度单位（RDU）表示。在siRNA实验中，β-肌动蛋白被用作内部对照。结果为代表性平均值±东南方共进行3次实验，一式三份*P（P）< 0.05.
图4。
图4。
APPL1是由AdipoR1驱动的Shp2活化的激酶。A类)用脂联素处理的肌成纤维细胞裂解物进行IP和抗AdipoR1，然后用抗APPL1和抗AdipoR1进行Western blot。B类)IP和抗AdipoR2，以及随后的Western blot分析和抗APPL1和抗AdipoR2。C类)细胞裂解产物经IP和抗APPL1处理，然后用抗-Shp2 Tyr542、抗Shp2和抗APPM1进行Western blot分析。D类)体外激酶分析证明APPL1作为激酶，能够激活Shp2。结果显示，APPL1的IP与重组Shp2孵育。Western blot抗体包括抗Shp2-Tyr542、抗Shp2和抗APPL1。E类,F类)慢病毒载体与非靶向shRNA相比AdipoR1和AdipoR2的shRNA敲除的蛋白质印迹分析。G公司)暴露于脂联素的活化HSC随后进行p-FAK、p-Shp2、总FAK和总Shp2的Western blot。通过Western blot分析中检测磷酸化酪氨酸残基576/577的抗p-FAK评估，AdipoR1的敲除恢复了FAK磷酸化。H（H）)AICAR不能诱导p-FAK的Shp2磷酸化和去磷酸化。结果代表平均值±东南方共进行3次实验，一式三份*P（P）< 0.05.
图5。
图5。
脂联素可防止僵硬相关的FAK磷酸化。在从大鼠肝脏中获取HSC后，将细胞镀到组织培养塑料上，该塑料涂有硬度增加（0.4–15 kPa）的凝胶基质以及纤维连接蛋白。A类)通过免疫荧光显微镜（蓝色，DAPI核染色；绿色，p-FAK-Tyr576/577染色）分析未处理的HSC（上图）或用ADP355（中间图）和脂联素处理6小时的HSC（下图），以确定p-FAK的存在。可以看出，脂联素治疗的HSC中p-FAK的染色强度降低，尤其是在9和15 kPa时。这里，纤维连接蛋白作为最大硬度的阳性对照，相当于组织培养塑料。原始视图为×400。B类)ADP355或脂联素治疗后p-FAK染色相对强度的密度测定A类)与控件相比（中的顶部面板A类). 图像是多种独立实验的代表*P（P）< 0.05.
图6。
图6。
主要调查结果摘要。脂联素介导激活HSC中FA复合物的破坏。脂联素可以与这两种受体结合，但shAdiopR1数据显示，AdipoR1通过激活作为激酶的适配器蛋白APPL1，负责与FAK失活和FA分解相关的下游事件，并导致Shp2磷酸化。活化的Shp2反过来导致FAK去磷酸化，激酶部分失活，阻止或破坏FA组装。脂联素还抑制关键整合素的表达，其他蛋白质对ECM沉积至关重要。
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