Mouse hepatocyte overexpression of NF-κB-inducing kinase (NIK) triggers fatal macrophage-dependent liver injury and fibrosis

doi:10.1002/hep.27348

.2014年12月；60(6):2065-76.

doi:10.1002/hep.27348。 Epub 2014年10月29日。

小鼠肝细胞NF-κB诱导激酶（NIK）过度表达引发致命的巨噬细胞依赖性肝损伤和纤维化

洪深¹, 梁升, 郑晨, 林江, 苏浩然, 雷音, M Bisher Omary先生, 梁友瑞

附属公司

PMID： 25088600
预防性维修识别码：项目经理4245385
内政部： 10.1002/庚27348

小鼠肝细胞NF-κB诱导激酶（NIK）过度表达引发致命的巨噬细胞依赖性肝损伤和纤维化

洪深等。肝病学. 2014年12月.

.2014年12月；60(6):2065-76.

doi:10.1002/hep.27348。 Epub 2014年10月29日。

作者

洪深¹, 梁生, 郑晨, 林江, 苏浩然, 雷音, M Bisher Omary先生, 梁友瑞

附属

¹密歇根大学医学院分子与综合生理学系，密歇根州安阿伯。

PMID： 25088600
预防性维修识别码：项目经理4245385
内政部： 10.1002/庚27348

摘要

受损、坏死或凋亡的肝细胞释放损伤相关的分子模式，引发无菌炎症，而肝脏炎症会导致肝损伤和纤维化。在这里，我们确定了肝核因子κB（NF-κB）诱导激酶（NIK），一种Ser/Thr激酶，是致命性肝脏炎症的新触发因素。NIK被广泛的刺激激活。在小鼠和人类受伤的肝脏中，其表达上调。在原代小鼠肝细胞中，NIK过度表达刺激了许多激活骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的趋化因子和细胞因子的释放，这与细胞损伤和死亡无关。BMDM反过来分泌促凋亡分子，刺激肝细胞凋亡。NIK转基因的肝细胞特异性表达引发了大规模的肝脏炎症、氧化应激、肝细胞凋亡和肝纤维化，导致体重减轻、低血糖和死亡。枯否细胞/巨噬细胞的耗竭逆转了NIK诱导的肝脏破坏和死亡。

结论：肝细胞NIK-肝免疫细胞轴促进肝脏炎症、损伤和纤维化，从而推动肝病进展。

PubMed免责声明

数字

**图1。肝损伤与肝脏NIK活性增加有关**
（A-B）肝脏NIK表达通过qPCR定量，并归一化为18S水平。Con:n=4，CCl4:n=7；C类开：n=4，酒精：n=5。（C）通过qPCR测量人类肝脏样本中NIK mRNA水平，并将其归一化为GAPDH水平。Con:n=2；ALD：n=6；PBC：n=3。（D-E）用NF-κB2或微管蛋白抗体对肝脏提取物进行免疫印迹。（F）从人体样品中制备肝脏提取物，并用抗NF-κB2抗体进行免疫印迹。相同的印迹用考马斯蓝染色以显示总蛋白**p<0.05*.

**图2。成人发病，肝细胞特异性NIK过度表达导致致命性肝损伤**
（A-B）*NIK止动块*小鼠感染GFP（Con）或*白蛋白*-经尾静脉注射的Cre腺病毒。用所示抗体对组织提取物进行免疫印迹。（C）体重（Con:n=6；Cre:n=六）、非预测血糖（Con:n=4；Cre:n=四）和生存曲线（Con:n=4；CR:n=5）。（D）感染18天后血浆ALT和ALP活性及总胆红素水平。Con:n=6；Cre:n=5。（E）*NIK止动块*用AAV-GFP或AAV-Cre感染小鼠，并监测体重和脱脂血糖。AAV-GFP:n=3；AAV-Cre:n=3。（F）感染9天后测定血浆ALT活性和总胆红素水平。AAV-GFP:n=3；AAV-Cre:n=3**p<0.05*.

**图3。成人发病、肝细胞特异性NIK过度表达导致肝脏氧化应激和肝细胞死亡**
（A-C）*NIK止动块*在GFP（Con）或*白蛋白*-Cre腺病毒感染。（A）肝脏重量。BW：体重。Con:n=6；Cre:n=6。（B）肝切片的H&E染色。（C）肝切片用TUNEL试剂和DAPI联合染色。插入：放大的合并图像。TUNEL阳性细胞归一化为DAPI阳性细胞。Con:n=5；Cre:n=5。（D）*停止-尼克*用AAV-GFP或AAV-Cre感染小鼠，并用TUNEL试剂和DAPI对肝切片（感染后9天）进行染色。AAV-GFP:n=3；AAV-Cre:n=3。（E）肝提取物（腺病毒感染后18天）用所示抗体进行免疫印迹。（F）肝脏ROS水平（标准化为蛋白质水平）。a.u.：任意单位。Con:n=6；Cre:n=5；AAV-GFP:n=3；AAV-Cre:n=3**p<0.05*.

**图4。成人发病、肝细胞特异性NIK过度表达导致肝脏炎症和纤维化**
*NIK止动块*在GFP（Con）或*白蛋白*-Cre腺病毒感染。（A）肝脏切片用F4/80抗体进行免疫染色。F4/80阳性细胞归一化为DAPI阳性细胞。Con:n=6；Cre:n=5。（B）肝脏mRNA的丰度（归一化为18S水平）。Con:n=5-6；Cre:n=6。（C）肝切片用Sirius红/固绿染色。将Sirius红阳性区域归一化为总显微区域。Con:n=6；Cre；n=6。（D）肝脏羟脯氨酸水平（标准化为肝脏重量）。Con:n=6；Cre，n=6。（E）用抗α-SMA或p85抗体对肝脏提取物进行免疫印迹。（F）肝切片用α-SMA抗体进行免疫染色。α-SMA阳性区域被标准化为微观区域。Con：n=4；Cre:n=4**p<0.05*.

**图5。胚胎发病、肝细胞特异性NIK过度表达导致肝脏氧化应激、肝细胞死亡和肝损伤**
（A）体重和血糖水平。*：Con与Tg^+/+.条件：n=5-7；玻璃钢^+/−：n=5；玻璃钢^+/+：n=7-9。（B） 13周龄时的血液ALT和总胆红素水平。Con:n=7；玻璃钢^+/−：n=3-5；玻璃钢^+/+：n=9。（C-F）在13周龄时处死小鼠。（C）肝脏重量和活性氧水平（归一化为总蛋白水平）。Con:n=7；玻璃钢^+/−：n=3；玻璃钢^+/+：n=8-9。（D）肝切片的H&E染色。（E） TUNEL阳性细胞（归一化为DAPI阳性细胞）。Con:n=5；玻璃钢^+/+：n=5。（F）用所示抗体对肝脏提取物进行免疫印迹**p<0.05*.

**图6。胚胎发病、肝细胞特异性NIK过度表达导致肝脏炎症和纤维化**
（A）肝脏切片用抗F4/80抗体进行免疫染色（归一化为DAPI阳性细胞）。Con:n=5；玻璃钢^+/−：n=3；玻璃钢^+/+：n=5。（B）肝脏mRNA丰度。Con:n=4-5；玻璃钢^+/−：n=3；玻璃钢^+/+：n=5。（C）肝切片用天狼星红/快绿染色。Con:n=5；玻璃钢^+/−：n=3；玻璃钢^+/+：n=6。（D）肝脏羟脯氨酸水平。Con:n=7；玻璃钢^+/−：n=3；玻璃钢^+/+：n=8。（E）肝切片用α-SMA抗体进行免疫染色。（F）用抗α-SMA或p85抗体对肝脏提取物进行免疫印迹**p<0.05*.

**图7。枯否细胞/巨噬细胞的耗竭减弱NIK的有害影响**
（A）体重（H₂O： n=6；氯化钆_三：n=6）和空腹（5小时）血糖水平（18天后*白蛋白*-Cre感染，Con:n=6；Cre+H（Cre+H）₂O： n=12；Cre+GdCl_三：n=6）。（B）存活率。H（H）₂O： n=5；氯化钆_三：n=5。（C） 18天后血浆ALT和ALP活性及总胆红素水平*白蛋白*-Cre感染。H（H）₂O： n=6-8；氯化钆_三：n=6。（D）肝切片用TUNEL、Sirius红/固绿或F4/80或α-SMA抗体染色。Con:n=4-6；Cre+H型₂O： n=4-7；Cre+GdCl_三：n=5-6。（E）用所示抗体对肝脏提取物进行免疫印迹。（F）肝脏中的mRNA水平（标准化为18S水平）。Con:n=6；Cre+H（Cre+H）₂O： n=6；Cre+GdCl_三：n=5**p<0.05*.

**图8。肝脏NIK触发BMDM依赖性肝细胞凋亡**
（A）原代肝细胞感染β-Gal或NIK腺病毒。用所示抗体对细胞提取物进行免疫印迹。（B）细胞存活和凋亡。MTT：加仑：n=3，NIK:n=3；TUNEL:Gal:n=5；NIK:n=5。（C）原代肝细胞感染β-Gal（n=3）或NIK（n=3.）腺病毒。感染后42 h用qPCR检测基因表达。BMDM用NIK（n=3）或β-Gal（n=3）条件培养基处理。治疗18小时后测量基因表达。（D）原代肝细胞感染β-Gal、NIK、G885R或KA腺病毒，并与BMDM共培养2天。肝细胞用TUNEL试剂染色，TUNEL阳性细胞归一化为DAPI阳性细胞。Gal:n=5；NIK:n=5；G855R：n=5；KA：n=5。（E）原代肝细胞分离自*NIK止动块*感染GFP的小鼠（Con，n=5）或*白蛋白*-在不存在或存在BMDM的情况下（3天）进行Cre（n=5）腺病毒和TUNEL分析。（F）用指示的腺病毒感染原代肝细胞，并与BMDM或不与BMDM共培养2天。用指示的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹**p<0.05*.

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