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.2014年8月；42(14):8954-69.
doi:10.1093/nar/gku611。 Epub 2014年7月23日。

急性缺氧通过HDAC3和HEXIM1依赖机制影响P-TEFb，以促进基因特异性转录抑制

奥尔加·S·萨夫罗诺娃 1, Ken-Ichi Nakahama先生 2, 盛田一夫 三
附属公司

急性缺氧通过HDAC3和HEXIM1依赖机制影响P-TEFb，以促进基因特异性转录抑制

奥尔加·S·萨夫罗诺娃等。 核酸研究. 2014年8月.

摘要

低氧与多种生理和病理条件相关，并引发特定的转录反应。RNA聚合酶II的延伸能力由其C末端结构域上依赖于正转录延伸因子b（P-TEFb）的Ser2残基磷酸化调节。在这里，我们报告了缺氧在伸长水平抑制转录。其机制包括以HDAC3依赖的方式增强P-TEFb与其抑制剂HEXIM1的非活性复合物的形成。缺氧初级反应基因的微阵列转录组分析表明，约79%的这些基因依赖HEXIM1。P-TEFb的低氧抑制与其Cdk9和Cyclin T1亚单位乙酰化减少有关。缺氧导致Cdk9和HDAC3/N-CoR阻遏物复合体的核移位和共定位。我们证明所述机制与单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因的低氧抑制有关。因此，响应缺氧信号传导，Cdk9和Cyclin T1的HEXIM1和HDAC依赖性脱乙酰化改变了P-TEFb的功能平衡，导致转录抑制。

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数字

图1。
图1。
低氧时形成非活性P-TEFb复合物。(A类)在常氧（N）和缺氧（H）条件下，在有或无IL-1β的情况下处理细胞1小时，内源性Cdk9与HEXIM1和Cyclin T1的相关性。用兔抗Cdk九抗体免疫沉淀（IP）全细胞裂解物，然后用山羊抗Cyclin-T1和羊抗HEXIM1-抗体进行免疫印迹。用单克隆抗Cdk9抗体进行Western blot作为总免疫沉淀蛋白的对照。为了破坏核糖核蛋白复合物中的7SK snRNA，在免疫沉淀之前用RNase A处理一组细胞裂解物2小时。柱表示从独立免疫沉淀中获得的6个western blot的密度定量平均值(n个= 6); 巴，SE；NT，无IL-1β治疗*P（P）与常氧相比<0.05；#P（P）与IL-1β处理的正常毒性样品相比，<0.05。(B类)cMyc/His-taged Cdk9与HEXIM1在常氧（N）和缺氧（H）条件下的相关性。使用单克隆抗cMyc抗体对样品进行免疫沉淀，并按（a）所示进行分析。用兔抗Cdk9抗体进行Western blot作为总免疫沉淀蛋白的对照。所示数据代表两个独立实验之一。(C类)利用兔抗HEXIM1、小鼠抗Cdk9和山羊抗Cyclin T1抗体，通过P-LISA分析Cdk9-HEXIM1-和Cyclin-T1-HEXIM1的相互作用。HeLa细胞在有或无IL-1β的情况下暴露于缺氧1小时。蛋白质-蛋白质相互作用的PLA信号显示为白色斑点。细胞核用SYTO 16核酸蓝色染色。
图2。
图2。
I类HDAC耗竭对正常和缺氧HeLa细胞中7SK snRNA和N-CoR/HDAC3和Cdk9细胞分布的影响。(A类)I类HDAC的破坏对缺氧反应中无活性内源性P-TEFb复合物形成的影响。转染siRNA后48 h，HeLa细胞暴露于常氧（N）或缺氧（h）混合气体中1 h。用山羊抗细胞周期蛋白T1抗体免疫沉淀全细胞裂解物，并用兔抗HEXIM1和抗Cdk9抗体进行western blot分析。HDAC1、HDAC2和HDAC3的直接western blot作为siRNA介导的敲除的对照。用抗细胞周期蛋白T1抗体的Western blot作为总免疫沉淀蛋白的对照。(B类)内源性Cdk9（红色）和HDAC3（绿色）的定位。缺氧、IL-1β或两者联合作用2h后，进行免疫荧光染色分析。(C类)免疫荧光显示内源性HDAC3（绿色）和N-CoR（红色）在IL-1β单独或与缺氧联合暴露2小时后的细胞定位。用TO-PRO-3（蓝色）对核酸进行染色。
图3。
图3。
Cdk9和Cyclin T1乙酰化的缺氧抑制。(A类)Cdk9在赖氨酸残基处乙酰化的细胞内分布对缺氧的反应。使用或不使用500 nM TSA预处理HeLa细胞1 h，然后暴露于缺氧中1 h。使用兔抗AcLys和小鼠抗Cdk9抗体通过P-LISA分析乙酰化Cdk9。(B类)Cdk9在常氧（N）或缺氧（h）混合气体（含或不含IL-1β）下暴露1小时后发生乙酰化反应。免疫沉淀的Cdk9用抗乙酰赖氨酸（AcLys）或Cdk9抗体进行免疫印迹检测。本试验中使用的所有缓冲液均补充100 ng/ml TSA，以阻断内源性HDAC活性。(C类)使用兔抗AcLys抗体和山羊抗Cyclin T1抗体通过P-LISA分析乙酰化CyclinT1的细胞内分布。使用或不使用500 nM TSA预处理HeLa细胞1 h，然后暴露于缺氧1 h。使用TOPRO-3（蓝色）对核酸进行染色。
图4。
图4。
HDAC在Cdk9和Cyclin T1低氧脱乙酰化中的作用。在用针对HDAC1、HDAC2或HDAC3的siRNA转染后48小时，将HeLa细胞在常氧或缺氧下暴露1小时。(A类)使用兔抗AcLys抗体和小鼠抗Cdk9抗体通过P-LISA分析乙酰化Cdk 9。(B类)使用兔抗AcLys抗体和山羊抗Cyclin T1抗体通过P-LISA分析乙酰化CyclinT1。P-LISA信号显示为白色，细胞核显示为蓝色。
图5。
图5。
低氧通过抑制IL-1β诱导的Pol II CTD的Ser2磷酸化来抑制MCP-1 mRNA的合成。(A类)低氧对MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响。HeLa细胞暴露于无（NT）或有IL-1β的常压或缺氧环境中1 h。用Q-PCR三次定量mRNA水平，并用18S rRNA水平归一化mRNA水平。数据表示为常压下的表达百分比*P（P）< 0.05; **P（P）与常压相比，<0.01；#P（P）< 0.05;##P（P）与IL-1β处理的正常毒性样品相比，<0.01。(B类)IL-1β和/或缺氧治疗指定时间后，通过ChIP分析，分析Pol II Rbp1启动子对IL-8和MCP-1基因的占用情况。(C类)在正常氧或缺氧条件下，用IL-1β处理细胞的MCP-1和IL-8基因启动子上设定的Pol II CTD的Ser5和Ser2残基的磷酸化状态。(B-C公司)免疫沉淀的DNA通过一式三份的Q-PCR进行定量，并在标准化后通过在0分钟时间点以结合百分比表示的10%输入进行定量*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，与0分钟时的结合相比(D类)MCP-1和IL-8启动子上P-TEFb富集的ChIP分析。用IL-1β和/或缺氧处理HeLa细胞指定的时间段。使用Cdk9和Cyclin T1抗体进行DNA免疫沉淀，并通过Q-PCR数据进行量化，数据表示为在归一化后的30分钟或60分钟时间点正常细胞中结合的百分比，输入量为10%**P（P）与常压相比<0.01；##P（P）与IL-1β处理的正常毒性样品相比，<0.01。
图6。
图6。
低氧介导的MCP-1基因阻遏需要HEXIM1。(A类)siRNA缺失Fcp-1和HEXIM1对MCP-1和IL-8 mRNA表达对缺氧的反应性的影响。siRNA转染48小时后，用IL-1β联合常氧或缺氧处理细胞6小时。分离总RNA并用RT-qPCR进行分析。数据通过18S rRNA表达进行标准化，并表示为用打乱的对照siRNA转染的正常氧样本的表达百分比。数据是两个独立实验的代表。(B类)HMBA治疗模拟了缺氧对MCP-1 mRNA表达的影响。用IL-1β单独或联合低氧或HMBA指示浓度处理HeLa细胞6 h。用18S rRNA使MCP-1 mRNA水平正常化。正常氧细胞中的表达水平设为100%**P（P）与常压相比，<0.01。
图7。
图7。
核受体辅阻遏物在低氧抑制MCP-1表达中的作用。(A类)在常氧或缺氧条件下用IL-1β治疗6小时前48小时，用200 pmol的N-CoR或SMRT siRNA转染细胞。用Q-PCR检测MCP-1和IL-8 mRNA，一式三份。用对照siRNA转染细胞并在常压下用IL-1β处理的细胞中的表达设为100%*P（P）< 0.05; **P（P）与常氧+IL-1、siScr相比，<0.01；#P（P）< 0.05;##P（P）与正常氧+IL-1、siN-CoR或siSMRT相比，<0.01。(B类)在IL-1β和缺氧处理的细胞中，相对N-CoR和SMRT与MCP-1和IL-8启动子的指定区域结合。免疫沉淀DNA通过Q-PCR定量，并在归一化后通过10%的输入量表示为0分钟时间点的结合百分比*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，与0分钟时的结合相比。
图8。
图8。
低氧初级反应的微阵列分析和HEXIM1依赖基因的鉴定。用对照（siScr）和HEXIM1靶向（siHEXIM）双链siRNA转染HeLa细胞，并在IL-1β联合常氧（N+IL）或缺氧（h+IL）处理48 h后转染细胞(A类)缺氧下调基因的文氏图及其对HEXIM1的依赖性。(B类)缺氧上调基因的文氏图及其对HEXIM1的依赖性。(C类)缺氧时表达降低的探针中HEXIM1依赖基因的微阵列鉴定。(D类)缺氧条件下表达增加的探针中HEXIM1依赖性基因的微阵列鉴定。(E类)P-TEFb缺氧抑制模型。低氧增强了具有内源性抑制剂Hexim1和7SK snRNA的非活性P-TEFb复合物的形成。这一过程需要HDAC3/N-CoR阻遏物复合物。P-TEFb的抑制通过P-TEFbCdk9亚单位和细胞周期蛋白T1的HDAC依赖性去乙酰化介导。通过未知机制激活P-TEFb需要HDAC2。
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