Discovery of selective inhibitors of Glutaminase-2, which inhibit mTORC1, activate autophagy and inhibit proliferation in cancer cells

doi:10.18632/oncotarget.2173

.2014年8月15日；5(15):6087-101.

doi:10.18632/目标2173。

发现抑制mTORC1、激活自噬和抑制癌细胞增殖的谷氨酰胺酶-2选择性抑制剂

附属公司

¹台湾苗栗国立卫生研究院生物技术与药物研究所；这些作者对这项工作做出了同样的贡献。
²台湾高雄市高雄医科大学药学院药学院。
^三美国马萨诸塞州波士顿哈佛大学公共卫生学院生物科学部遗传与复杂疾病系。
⁴台湾苗栗国立卫生研究院生物技术与药物研究所。
⁵台湾苗栗国立卫生研究院生物技术与药物研究所；国立清华大学分子与细胞生物学研究所医学生物技术研究生项目，台湾新竹。

PMID： 25026281
PMCID公司：项目经理4171615
内政部： 10.18632/目标2173

发现抑制mTORC1、激活自噬和抑制癌细胞增殖的谷氨酰胺酶-2选择性抑制剂

李月姿等。 Oncotarget公司. 2014.

.2014年8月15日；5(15):6087-101.

doi:10.18632/oncotarget.2173。

作者

附属公司

¹台湾苗栗国立卫生研究院生物技术与药物研究所；这些作者对这项工作做出了同样的贡献。
²台湾高雄市高雄医科大学药学院药学院。
^三美国马萨诸塞州波士顿哈佛大学公共卫生学院生物科学部遗传与复杂疾病系。
⁴台湾苗栗国立卫生研究院生物技术与药物研究所。
⁵台湾苗栗国立卫生研究院生物技术与药物研究所；国立清华大学分子与细胞生物学研究所医学生物技术研究生项目，台湾新竹。

PMID： 25026281
PMCID公司：下午171615
内政部： 10.18632/目标2173

摘要

谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸，参与癌细胞的Warburg效应。已鉴定出两个人类谷氨酰胺酶基因，GLS（GLS1）和GLS2。每个谷氨酰胺酶基因都有两种替代转录物：第一，GLS的肾脏亚型（KGA）和谷氨酰胺酶C（GAC）；其次，GLS2的肝脏亚型（LGA）和谷氨酰胺酶B（GAB）。虽然GLS1被认为是癌症的治疗靶点，但GLS2在癌症中的潜在作用尚不清楚。在此，我们发现一系列烷基苯醌优先抑制谷氨酰胺酶B亚型（GAB，GLS2），而不是谷氨酰胺酶肾亚型（KGA，GLS1）。我们确定了变构结合囊中负责选择性的氨基酸残基。烷基苯醌处理降低了细胞内谷氨酰胺酶活性和谷氨酸水平。烷基苯醌或GLS2 siRNA对GLS2的抑制可降低癌细胞增殖和锚定非依赖性集落形成，并通过AMPK介导的mTORC1抑制诱导自噬。我们的发现证明了谷氨酰胺酶同工酶选择性抑制的氨基酸序列，并验证了GLS2是一个潜在的抗癌靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

**图1。谷氨酰胺酶抑制烷基苯醌的动力学研究**
（A）*大肠杆菌*在卡那霉素存在的Luria-Bertani肉汤培养基中培养含有pET28a（+）-KGA或pET28a-GAB的BL21（DE3）pLysS，其中KGA或GAB蛋白由0.5 mM IPTG诱导表达。将所得细胞裂解液进行超声处理并离心分离，以获得细胞颗粒（通道1）和上清液（通道2）的部分。使上清液通过亲和柱（HisTrapTM HP），在泳道3中显示流通，在泳道4中显示用100mM和150mM咪唑洗涤KGA（左图）或用50mM咪唑洗涤GAB（右图）。所示通道5是含有500 mM咪唑用于KGA（左侧面板）或200 mM咪唑啉用于GAB（右侧面板）的洗脱液。分子标记表示为kDa。（B）无磷酸盐条件下活性烷基苯醌AV-1对KGA的抑制模式。（C）在无磷酸盐的情况下，活性烷基苯醌AV-1对GAB的抑制模式。Cheng-Prusoff方程，Ki=IC₅₀/（1+[S]/K）_米)，用于计算KGA=1.20±0.06μM和GAB=0.14±0.01μM时AV-1的Ki值。（D）在无磷酸盐的情况下，烷基苯醌对纯化的重组KGA和GAB的剂量依赖性抑制。

**图2。GAB中AV-1的对接研究和结合位点分析**
（A） GAB中AV-1结合位点的对接模拟。品红：H408组氨酸；黄色：Q452谷氨酰胺；橙色：K453赖氨酸；红色：S456丝氨酸；青色：H461组氨酸；蓝色：K472赖氨酸；虚线：氢键相互作用。AV-1的化学结构与GAB的相互作用残基显示出来。（B） GAB四聚体中AV-1的拟议结合概述。左面板显示顶视图，右面板显示侧视图。为清晰起见，AV-1以红色和绿色棒状图表示，谷氨酸分子以橙色球体表示。（C）模拟AV-1结合位点周围人类KGA和人类GAB的一级序列比对。关键交互残基用箭头表示。GAB对KGA选择性的突变位点用红色箭头表示。（D）集成电路₅₀GAB或KGA野生型和突变酶的AV-1和BPTES值和选择性指数。GAB残基Q452和K453突变为相应的KGA残基，产生GAB突变体GAB_Q452H、GAB_K453D和GAB_Q 452H/K453D。将KGA的H519和D520残基突变为GAB的相应残基，产生KGA突变体KGA_H519Q、KGA_D520K和KGA_ H519Q/D520K。KGA的F318/F322和Y394残基突变为相应的GAB或细菌谷氨酰胺酶残基，产生KGA突变体KGA_F318Y/F322S和KGA_Y394L[3]。

**图3。通过AV-1化合物或RNA沉默抑制GLS2可显示抗癌细胞增殖和抗凤尾鱼非依赖性集落形成**
（A） GLS1和GLS2蛋白在癌细胞HepG2和A549以及正常成纤维细胞系底特律551和WI-38中的表达。（B）活性烷基苯醌对癌细胞HepG2和A549的剂量依赖性生长抑制。（C）通过敲低AV-1或GLS2抑制GLS2对HepG2细胞集落形成的影响。（D）敲除GLS2表达显著抑制HepG2和A549细胞的生长。所示为未转染（亲本）细胞、shRNA对照细胞（shRNA对照）和GLS2 shRNA敲除细胞的GLS2表达水平和生长曲线的western blot分析**P<0.005。（E） AV-1处理降低了细胞内谷氨酰胺酶活性。（F） AV-1处理降低了细胞内谷氨酸水平。用AV-1或BPTES处理的细胞裂解物接受谷氨酰胺酶活性测定和谷氨酸盐水平（见实验程序）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。参见图S1和表S1。

**图4。AV-1通过激活AMPK和ULK1诱导细胞自噬**
（A） AV-1治疗对HepG2细胞凋亡诱导和自噬的影响，表现为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3或LC3B的裂解。（B） AV-1对AMPK激活的影响。C.AV-1对ULK1和BCL2相关Beclin1激活的影响。HepG2细胞用载体（DMSO）或AV-1处理不同时间，如所示，然后用所示抗体进行细胞裂解蛋白印迹分析。所示结果代表了三个独立的实验。

**图5。AV-1通过AMPK激活抑制mTORC1**
（A） AV-1对mTORC1失活的影响。（B） AMPK抑制逆转AV-1相关的mTORC1抑制。HepG2细胞经载体（DMSO）、AV-1或化合物C（AMPK抑制剂）处理不同时间，如细胞裂解前所示，以进行所示抗体的西方分析。（C）说明AV-1抑制谷氨酰胺酶，通过AMPK激活和mTORC1抑制激活自噬途径的方案。所示结果代表了三个独立的实验。另请参见图S2。

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