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.2014年8月；141(15):3040-9.
doi:10.1242/dev.106518。 Epub 2014年7月3日。

先天性心脏病蛋白5与CASZ1联合维持心肌组织完整性

斯蒂芬·索伊卡 1, 尼拉夫·阿明 2, 德文·吉布斯 三, 凯萨琳·S·克里斯汀 1, Marta S Charpentier公司 2, 弗兰克·L·康隆 4
附属公司

先天性心脏病蛋白5与CASZ1结合维持心肌组织完整性

斯蒂芬·索伊卡等。 开发. 2014年8月.

摘要

鉴定和表征发育中心脏特定细胞类型的分化和形态发生所涉及的细胞和分子途径，对于理解心脏发育过程和与人类先天性心脏病相关的病理学至关重要。在这里，我们表明心脏转录因子CASTOR（CASZ1）直接与先天性心脏病5蛋白（CHD5）相互作用，CHD5蛋白也称为富含色氨酸的碱性蛋白（WRB），该基因位于唐氏综合征患者先天性心脏疾病的拟议区域的21号染色体上。我们证明，爪蟾CHD5缺失会导致心肌完整性受损，基底膜沉积不当，导致心脏无法进行与心脏形成相关的细胞运动。我们进一步报道CHD5对CASZ1功能至关重要，CHD5-CASZ1相互作用对心脏形态发生是必要的。总之，这些结果确立了CHD5和CASZ1在脊椎动物心脏发育早期的作用。

关键词：脚轮；CASZ1；CHD5；心脏的；心肌细胞；先天性心脏病；唐氏综合症；心脏发育；心脏形态发生；形态发生；增殖；WRB；非洲爪蟾。

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数字

图1。
图1。
CASZ1与CHD5相互作用。在酵母双杂交试验中，全长CASZ1（诱饵）与部分CHD5蛋白（猎物）相互作用。单元格置于–His/–Ade selection下。（C） 描述预测域的CHD5结构示意图。（D） 来源cDNA的RT-PCR爪蟾全胚胎裂解物。Ef1a公司用作加载控件。（E） 的表达式第5章RNA依据就地早期蝌蚪的分析爪蟾胚胎（37期）。h、 心脏；pr，前肾；e、 眼睛；pa，咽弓。发育细胞核中CHD5和CASZ1蛋白的（F-M）克隆化爪蟾（40期）心肌（m）。F-I中的白色方框对应J-M中的放大区域。比例尺：E中的500μM；F-I中为50μm；J-m中为5μm。
图2。
图2。
心脏形态发生需要CHD5。（A，B）CHD5缺失胚胎（37期）的心脏体积较小，循环不正确，无法形成腔室。用抗原肌球蛋白（Tmy）抗体进行全山抗体染色的侧视图。（C，D）CHD5耗竭的心脏不能发育出完全形成的心室，并且心肌层较厚。的横截面心脏肌动蛋白-EGFP转基因（CA-TG）爪蟾胚胎（37期）。早期蝌蚪的（E-M）三维重建爪蟾胚胎（37期）用抗原肌球蛋白抗体染色，从侧面和背面观察。CHD5缺失的心脏（H-M）不能完成迁移和融合（H-J，54%），或不能进行适当的循环和心室形成（K-M，31%）。只有15%显示正常循环。n个>每种条件25次，两次生物复制。v、 心室；o、 流出道；i、 流入通道。D、 背侧；A、 前部；五、 腹侧；P、 后部。比例尺：A-D中100μm；E-m中为50μm。
图3。
图3。
心脏形态发生需要CHD5。（A-D）扫描电子显微镜爪蟾（A）对照和（B-D）CHD5缺失胚胎中蝌蚪早期阶段（37期）的胚胎。CHD5缺失的胚胎不能完成环化并开始形成心室，也不能经历与线性心脏管的发育和成熟相关的正常细胞形状变化。o、 流出道；v、 心室。箭头表示腹中线心肌细胞融合失败。（E，F）CASZ1缺失的胚胎在心脏循环和心脏细胞形状变化方面表现出类似的缺陷。n个=10每种条件，两次生物复制。比例尺：50μm。
图4。
图4。
心肌组织粘连需要CHD5和CASZ1。CHD5和CASZ1缺失的CA-GFP胚胎（37期）的（A-L）横切面显示ZO-1的弥漫或减少表达，表明紧密连接形成缺陷。多个样本胚胎的表型(n个≥4，来自两个生物复制）。A-F中的方框勾勒出G-L中的放大图像。Merge代表ZO-1（红色）、DAPI（蓝色）和CA-GFP（绿色）。对照组、CHD5缺失和CASZ1缺失心肌（37期）横切面的（M-O）TEM成像显示，与对照胚胎相比，CHD5和CASZ1-缺失胚胎中靠近内心肌室（ic）的心肌细胞（箭头）之间存在较大的细胞间隙(n个≥2，来自两个生物复制）。比例尺：A-F中100μm；G-L中20μm；m-O中为5μm。
图5。
图5。
心肌基底膜沉积需要CHD5和CASZ1。（A-C）TEM成像显示，CHD5-和CASZ1-缺失胚胎的心肌基膜（bm）在心肌基底表面形成不连续膜（37期）(n个=2). （D-I）CHD5-和CASZ1-缺失的CA-GFP心脏（37期）显示层粘连蛋白耗尽或定位不当的区域（黄色箭头）。多个样本胚胎的表型(n个≥4，来自两个生物复制）。Merge代表层粘连蛋白（红色）、DAPI（蓝色）和CA-GFP（绿色）。比例尺：A-C中0.2μm；D-I中为100μm。
图6。
图6。
CASZ1和CHD5是心脏循环和心室形成前心肌组织粘附所必需的。（A-X）对照、CHD5缺失和CASZ1缺失的CA-GFP胚胎检查紧密连接标记ZO-1（A-L）和claudin-5（M-X）的表达。CHD5-和CASZ1-缺失心脏（33期）横切面中ZO-1和claudin-5的表达均减少，呈弥漫性和无组织性。多个样本胚胎的表型(n个≥4). A、B、E、F、I、J、M、N、Q、R、U、V中的白色方框分别对应C、D、G、H、K、L、O、P、S、T、W、X中的放大图像。Merge表示ZO-1或claudin-5（红色）、DAPI（蓝色）和CA-GFP（绿色）。比例尺：A、B、E、F、I、J、m、N、Q、R、U、V中的100µm；C、D、G、H、K、L、O、P、S、T、W、X中20µm。
图7。
图7。
CHD5对CASZ1功能至关重要。（A，B）使用酵母双杂交分析鉴定了CASZ1的区域，该区域包含最小CHD5相互作用域氨基酸残基785-998。（C-N）控制（C-E）和CASZ1-完成（F-H）爪蟾胚胎与早期蝌蚪期（37期）共注射编码全长CASZ1（I-K）或CASZ1ΔCID（L-N）mRNA的CASZ1缺失胚胎进行比较。全长CASZ1部分挽救了心脏环路和心室形成（v）、流出道（o）和流入道（i）的形成，而CASZ1ΔCID未能挽救心脏发生的任何方面。（O-Q）三个独立实验(n个>使用抗原肌球蛋白抗体的整体染色对胚胎的贲门裂（O）、正常心环程度（P）和心室形成（Q）进行评分。进行Fisher精确检验以确定显著性：NS，不显著*P（P）=0.003; ***P（P）<0.0001. 误差条代表计算的标准误差。比例尺：500μm，单位为C、D、F、G、I、J、L、m；在E、H、K、N方向为100μm。
图8。
图8。
CASZ1 CID域干扰心脏发育。（A-D）蝌蚪早期（37期）的对照胚胎表现出循环和心腔的形成。v、 心室；o、 流出道；i、 流入通道。（E-L）CASZ1和CASZ1 CID表达错误的胚胎显示出流出道和流入道的不完全会聚，如背视图（I，K）（箭头）所示，以及部分闭合的流入道，如后视视图（H，L）所示（箭头）。n个=23，对于CASZ1 mis；n个=29，对于CASZ1 CID mis；两次生物复制。比例尺：100μm。
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