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.2014年6月；20(6):624-32.
doi:10.1038/nm.3543。 Epub 2014年5月18日。

心脏BIN1折叠T小管膜，控制离子流量并限制心律失常

婷婷红 1, 黄河阳 2, 张珊珊 三, Hee Cheol Cho先生 三, 玛丽亚·卡拉什尼科娃 三, 孙百鸣 三, 张浩 4, 阿纳米卡·巴尔加瓦 5, 迈克尔·格雷布 4, 杰弗里·奥尔金 6, 朱莉娅·戈雷利克 5, 爱德华多·马尔班 三, 莉莉·Y·简 7, 罗宾·M·肖 三
附属机构

心脏BIN1折叠T小管膜，控制离子流量并限制心律失常

婷婷红等。 自然·医学. 2014年6月.

摘要

心肌细胞T小管对调节离子流量很重要。桥接积分器1（BIN1）是一种与钙通道运输相关的T小管蛋白，在衰竭心脏中被下调。在这里，我们发现心脏T小管通常包含由心脏BIN1亚型形成的致密保护性内膜褶皱。在心脏Bin1缺失的小鼠中，T小管折叠减少，这不会改变心肌细胞的整体形态，但会导致局部细胞外钙和钾离子的自由扩散，延长动作电位持续时间，增加对室性心律失常的易感性。我们还发现，通过表达BIN1亚型BIN1+13+17，可以拯救T小管内折叠，该亚型可以促进N-WASP依赖的肌动蛋白聚合，从而稳定心脏Z盘的T小管膜。BIN1+13+17招募肌动蛋白折叠T小管膜，形成一个“模糊空间”，保护性地限制离子通量。当BIN1+13+17亚型的数量减少时，如后天性心肌病，T小管形态改变，可能导致心律失常。

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数字

图1
图1
心肌细胞T小管被BIN1紧密折叠。(α–b)典型共焦图像(一，比例尺：5µm）和荧光轮廓(b条)活WT和垃圾箱1用Di-8-ANNEPS标记的HT心肌细胞。(c（c）)T小管峰值强度的量化。(n个=40，来自4-5个单元格，P（P）< 0.0001). (d日)WT中的电池尺寸标准化膜电容(n个=14）和垃圾箱1HT（高温）(n个=12）心肌细胞(P（P）= 0.0181). WC表示报告的无T管的全电池电容。(e（电子）)WT和垃圾箱1HT心脏切片。比例尺（从左到右）：1µm、250 nm、100 nm和100 nm。(（f）)通过上图中的线条标记的单个T小管的电子密度分布图（中间），底部为平均T小管电子密度(n个=75，P（P）< 0.0001). (克)轴向横截面的T形管管腔面积(n个= 80,P（P）< 0.0001). (小时)心肌细胞T小管轮廓评分（1，圆形且无折叠和空间复杂性；2，非圆形且无褶皱和空间复杂性，或3，多折叠且空间复杂性）分布(n个= 196,P（P）< 0.0001). 数据以平均值±SEM表示，心肌细胞来自每个基因型的三只小鼠，并且使用每个基因型三只心脏的六个左心室切片进行TEM分析。学生的吨-统计学分析采用单因素方差分析和方差分析。
图2
图2
垃圾箱1缺失增加细胞外钙2+扩散。(一)LTCC介导的典型膜片钳记录我钙从2 mM细胞外钙溶液快速转变为5 mM无钙EGTA溶液后，WT心肌细胞发生变化。(b条)的动力学我钙使用中所述协议的当前更改(一)拟合出一个平台，然后是一个阶段的指数衰减。X（X）0是之前的初始延迟我钙腐烂。(c（c）)X的比较0对于WT和垃圾箱1HT.数据表示为平均值±SEM，P（P）=0.0001（按学生）吨-试验（每个基因型的心肌细胞来自3只小鼠）。(d日)描述钙扩散数学模型的显著特征的图表。(e（电子）)的动力学我钙使用模型计算的电流衰减(d日). 慢扩散区的标准化钙浓度可替代钙电流，因为它与向内钙直接相关2+驱动力。含有慢扩散区的WT T管模型与实验数据（黑色曲线-模型，黑色圆圈-数据）相匹配。拆除T形管左侧的扩散屏障(一)导致较短的初始延迟，如垃圾箱1HT实验（红色曲线-模型，红色方块-数据）。
图3
图3
垃圾箱1缺失增加细胞外钾+扩散，延长动作电位持续时间，增加心室异位。(一)典型膜片钳记录我K1型在野生型（WT）心肌细胞中快速切换细胞外钾浓度时电流发生变化。(b条)的动力学我K1型K期间+在WT和垃圾箱1HT心肌细胞（虚线，死体积时间124 ms）。(c（c）)初始延迟X的比较0共K个+在对于WT(n个=20）和垃圾箱1HT（高温）(n个=19）心肌细胞(P（P）=0.0045）。(d日)的动力学我K1型K期间+远离的(1−∆我K1型)WT和垃圾箱1HT心肌细胞。(e（电子）)X的比较0共K个+远离的对于WT(n个=20）和垃圾箱1HT（高温）(n个=19）心肌细胞(P（P）= 0.0018). (（f）)顶部：来自隔离和langendorff灌注WT的EKG（顶部）和TMP（跨膜电位，底部）的代表性轨迹（左侧）和垃圾箱1HT（右）心。底部：动作电位持续时间（APD80）总是延长垃圾箱1HT心脏是否受到低钾溶液（2.5 mM）、正常钾溶液（5 mM）和高钾溶液（8 mM）的影响（左），并且心室异位增加垃圾箱1HT心脏（右，生理缓冲灌注期间心律失常的发生率）。(克)WT的心室激活图（左）和传导速度（右）垃圾箱1对HT心脏进行高钾（8mM）灌注（*，P（P）< 0.05). 数据以平均值±SEM表示，心肌细胞来自每种基因型的三只小鼠，学生的吨-检验用于统计分析。
图4
图4
起搏和异丙肾上腺素β肾上腺素能激活引起的室性心律失常。(一)S1–S4刺激方案下的典型心电图记录。WT小鼠在起搏后立即恢复正常的窦房结搏动（顶面板），在垃圾箱1HT小鼠（中间组），在垃圾箱1HO鼠标（底部面板）。(b条)分析并比较三组患者对异丙肾上腺素的心率增加（∆HR）（平均值±SEM，n个= 3–4,P（P）通过单因素方差分析=0.04）。(c（c）)各组持续VT（>9 QRS）或VF的发生率(n个= 3–4,P（P）=0.03（按chi-square计算）。(d日)量化各组在异丙肾上腺素治疗前后室性心律失常的频率(n个= 3–4,P（P）双向方差分析结果<0.01）。
图5
图5
成年小鼠心肌细胞表达四种垃圾箱1拼接变体。(一)卡通垃圾箱1我们在成年小鼠心肌细胞中发现的外显子和剪接变异体。BAR，Bin–Amphiphysin–Rvs域；磷脂酰肌醇结合域；CLAP，氯氰菊酯/AP2结合区；MDB，myc-binding域；SH3，SRC同源3域。(b条)四个垃圾箱1在成年小鼠心肌细胞（A.M.C.）中，用PCR检测外显子10–18或外显子13–18两侧的引物集，检测到外显子13-17选择性包含的剪接变体。(c（c）)每个的百分比垃圾箱1用PCR引物集对外显子10–18进行亚克隆和测序后，成年小鼠心肌细胞中的变异。(d日)每种病毒的定量rtPCR分析垃圾箱1变体(料仓1/HPRT1)在纯化的新生儿心肌细胞（P3，n个=2窝，每窝8-10只幼崽）和分离的成年小鼠心肌细胞(n个=5只小鼠）。(e（电子）)Western blot分析证实了抗外显子17（克隆99D，Sigma）和抗外显元13（A#5299，Anaspec）BIN1抗体的抗体特异性。所有四种BIN1亚型均由panBIN1抗体（兔抗BIN1 SH3结构域）检测。(（f）)成年小鼠心肌细胞中抗外显子17和抗外显子13标记的免疫荧光（红色箭头，α-肌动蛋白或Cav1.2共标记的Z-line/TT区域）。(克)WT和垃圾箱1过表达GFP、BIN1、BIN1+13、BIN1+17或BIN1+1+17的HT心肌细胞(n个=5个单元格）。数据表示为平均+/-SEM。*，P（P）<0.05；**，P（P）<0.01，和***，P（P）<0.001（按学生）吨-测试或双向方差分析。
图6
图6
BIN1+13+17使用F-actin连接到Z盘α-actinin。（a–b）表达GFP标记的BIN1、BIN1+13、BIN1+17和BIN1+13+17的HeLa细胞（比例尺：10µm）(一)，褶皱状结构（线性条纹）的长度量化为(b条). （平均值±SEM；n个=5个单元格的20倍；***表示P（P）<0.001（单向方差分析）。(c（c）)TEM证实，BIN1+13+17而非BIN1+17在HeLa细胞中诱导了拉长的膜折叠。比例尺：1微米（左侧）和0.5微米（右侧两个面板）。(d日)表达GFP-BIN1亚型（绿色）和LifeAct-mCherry亚型（红色）的HeLa细胞（比例尺：10µm）。(e（电子）)HeLa细胞中GST-BIN1亚型和N-WASP-V5的GST下拉。(（f）)使用纯化的Arp2/3、N-WASP和BIN1亚型进行体外芘-肌动蛋白聚合分析。左图，肌动蛋白聚合动力学的代表性追踪。对，聚合动力学的Vmax数据。数据表示为平均值±SEM(n个=5，*表示P（P）单向方差分析结果<0.05）。阴性对照含有单独的芘-肌动蛋白和GST控制蛋白（GST-GFP，底部黑线用下箭头表示），阳性对照含有添加Arp2/3和VCA（N-WASP的活性域，顶部黑线用上箭头表示）的芘-actin，其余样品含有添加Arp2/3的芘-actin，N-WASP与GST-GFP或1µM GST-BIN1亚型。(克)将纯化的GST-BIN1融合蛋白预包衣谷胱甘肽珠添加到成人心脏裂解液中，以下拉α-肌动蛋白（右）或F-肌动蛋白。(小时)BIN1+13+17在T小管内形成细胞外离子扩散屏障的示意图。
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