Structural determinants in GABARAP required for the selective binding and recruitment of ALFY to LC3B-positive structures

doi:10.1002/embr.201338003

.2014年5月；15(5):557-65.

doi:10.1002/embr.201338003。 Epub 2014年3月25日。

ALFY与LC3B阳性结构选择性结合和招募所需的GABARAP中的结构决定因素

阿尔夫·孔·利斯塔德¹, 一村吉野, 高木贤二, 杨银杰, 塞尔希·潘基夫, 尤米·卡内加, 顺山（Shun Kageyama）, 铃木美子, 斋藤义木, 水岛纯弘, 小松Masaaki, 安妮·西蒙森

附属公司

PMID： 24668264
预防性维修识别码：下午4点210083分
DOI（操作界面）： 10.1002/embr.201338003

ALFY与LC3B阳性结构选择性结合和招募所需的GABARAP中的结构决定因素

阿尔夫·孔·利斯塔德等。 EMBO代表. 2014年5月.

.2014年5月；15(5):557-65.

doi:10.1002/embr.201338003。 Epub 2014年3月25日。

作者

阿尔夫·孔·利斯塔德¹, 一村义信, 高木贤二, 杨银杰, 塞尔希·潘基夫, 尤米·卡内加, 顺山（Shun Kageyama）, 铃木美子, 斋藤义木, 水岛纯弘, 小松Masaaki, 安妮·西蒙森

附属

¹挪威奥斯陆奥斯陆大学基础医学研究所。

PMID： 24668264
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DOI（操作界面）： 10.1002/embr.201338003

摘要

一些自噬蛋白包含一个LC3-相互作用区域（LIR），负责与Atg8同源蛋白的相互作用。这里，我们证明ALFY通过其WD40域中的LIR选择性地与LC3C和GABARAP结合。ALFY与GABARAP的结合对于其向LC3B阳性结构的募集以及通过自噬清除某些p62结构是必不可少的。此外，GABARAP-ALFY-LIR肽复合物的晶体结构确定了GABARAPs中负责与ALFY结合的三个保守残基。有趣的是，在LC3B中引入这些残基足以使其与ALFY相互作用，这表明LIR结合疏水囊外的残基赋予了与Atg8同源蛋白相互作用的特异性。

PubMed免责声明

数字

**图1。ALFY的C末端区域与GABARAP相互作用**
用U2OS细胞总提取物中的μMACS™免疫沉淀转染的GFP-Atg8同源物，然后用抗GFP和抗ALFY抗体进行免疫印迹分析。数据是两个独立实验的代表。B（C）中用于GST下拉实验的ALFY缺失突变结构的概述。C所示³⁵S标记的*在体外*-翻译的GFP标记的构建物与GST、GST-LC3B或与谷胱甘肽Sepharose偶联的GST-GABARAP孵育，并通过放射自显影术（ARG）评估其结合。5%的*在体外*-加载所用的翻译蛋白（箭头）。考马斯亮蓝（CBB）染色显示，使用了等量的GST蛋白。数据是三个独立实验的代表。D重组ALFY（aa 2981–3526）与结合谷胱甘肽Sepharose的GST-Atg8蛋白孵育。将下拉复合物进行SDS-PAGE和抗ALFY和抗GST免疫印迹。使用5%的重组ALFY蛋白作为输入。数据是三个独立实验的代表。可在线获取此图的源数据。

**图2。ALFY中LC3相互作用区域（LIR）的识别**
人类ALFY潜在LIR与哺乳动物、鸟类、鱼类和昆虫代表的相应同源序列的比对。Ω表示芳香族残基，Ψ表示脂肪族残基。B类³⁵S标签*在体外*-翻译的GFP-ALFY（aa 2981–3526）野生型和不同的LIR突变体与GST-GABARAP或-LC3C孵育，并通过ARG评估结合。10%和2%*在体外*-用翻译后的蛋白负载来说明结合亲和力。CBB染色显示使用了等量的GST蛋白。数据是三个独立实验的代表。C MBP、MBP-ALFY（aa 3255–3526）或与直链淀粉树脂偶联的ALFY-LIR突变体（F3346A）在没有或存在纯化GABARAP的情况下培养。将拉下的复合物进行SDS-PAGE，并通过CBB染色进行可视化。数据是三个独立实验的代表。D ALFY-LIR肽（aa 3341–3354）到Atg8同源物的热力学参数。所有滴定均在25°C下进行，如补充方法所述。ITC数据拟合到一个单站点绑定模型。ND，未检测到。E类³⁵S标签*在体外*-翻译的GFP或GFP-Bchs（aa 3326–3341）与GST或GST-dAtg8a孵育，并由ARG评估结合。5%的*在体外*-装载所用的翻译蛋白。Ponceau染色显示使用了等量的GST蛋白。数据是三个独立实验的代表。可在线获取此图的源数据。

**图3。GABARAP-ALFY肽复合物的结构分析**
由棕色GABARAP和黄色ALFY-LIR肽形成的复合物的整体结构，核心LC3相互作用区（LIR）基序以深蓝色突出显示。B使用UCSF Chimera将GABARAP-ALFY-LIR肽复合物结构与LC3B（1UGM）的已发表结构对齐。有关ALFY-LIR肽中突出显示为棒状的残基与GABARAP或LC3B中相应注释残基之间的距离的计算，请参见补充图S2C和D。人类Atg8蛋白同源物的C序列比对。通过Clustal W.获得对齐。黑色和灰色背景表示相似程度。闭圈表示参与ALFY-LIR肽相互作用的GABARAP的特定残基。用GFP-TRAP®从稳定转染HeLa FlpIn细胞的总细胞裂解液中免疫沉淀D GFP-LC3B和GFP-LC3 B（Q26K/H27Y/H57D），然后用SDS-PAGE和所示抗体进行免疫印迹。数据是三个独立实验的代表。E MBP-ALFY公司_3255–3526与直链淀粉树脂缀合的与GST或所指示的GABARAP突变体一起孵育。将拉下的复合物进行SDS–PAGE，并通过抗MBP和抗GABARAP抗体的免疫印迹进行可视化。数据是三个独立实验的代表。F MBP标记ALFY_3255–3526和第62页_168–391或其相应的LIR突变体（分别为F3346A和W340A）与直链淀粉树脂偶联，并与纯化的GST、GABARAP、GABARA突变体（K24Q/Y25H/D54H）、LC3B或LC3B突变体（Q26K/H27Y/H57D）孵育。用抗GABARAP、抗LC3和抗MBP抗体免疫印迹法观察结合蛋白。数据是三个独立实验的代表。G公司³⁵S标签*在体外*-翻译的GFP-ALFY（aa 2981–3526）野生型和K3343A/D3344A/Y3351A突变体与GST-LC3B和GABARAP孵育，并通过ARG评估结合。10%*在体外*-装载所用的翻译蛋白。CBB染色显示使用了等量的GST蛋白。数据是三个独立实验的代表。可在线获取此图的源数据。

**图4。ALFY和GABARAP相互作用的生理作用**
在用抗ALFY抗体染色之前，用蛋白酶体抑制剂（MG132，2 h）处理HeLa-FlpIn-GFP-GABARAP细胞或进行氨基酸饥饿处理（EBSS，2小时）。比例尺，10μm。B GFP标记的全长ALFY野生型或LC3-相互作用区（LIR）突变体被表达到*阿尔菲*-使用腺病毒系统的缺陷MEF。感染后48小时，MEF在正常培养基或EBSS中培养1.5小时，然后用抗LC3B或抗GABARAP抗体染色。比例尺10μm。用靶向GABARAP、GABARAPL1和GABARAP2的对照或siRNA处理C HeLa细胞。转染72h后用抗LC3B、抗ALFY和抗p62抗体对细胞进行免疫染色。比例尺，10μm。用靶向ALFY的对照或siRNA处理D HeLa细胞。转染后72小时，用嘌呤霉素加或不加巴非霉素A1处理细胞2小时，将总细胞裂解物分为TX-100可溶和不可溶部分。然后用所示抗体对TX-100可溶性/不溶性部分进行免疫印迹。数据是三个独立实验的代表。用嘌呤霉素或EBSS处理E ALFY WT和KO MEF（含或不含巴非霉素A1）2 h，然后将总细胞裂解物分馏成Triton X-100（TX-100）可溶和不可溶部分。然后用所示抗体对TX-100可溶性/不溶性部分进行免疫印迹。数据是三个独立实验的代表。F ALFY介导的选择性自噬示意图模型。可在线获取此图的源数据。

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