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.2014年5月；24(5):576-94.
doi:10.1038/cr.2014.33。 Epub 2014年3月25日。

MARCKS调节Rab10囊泡的膜靶向性以促进轴突发育

徐晓慧 1, 蔡云登 2, 杨柳 2, 苗河 2, 简鹏 三, 王彤（Tong Wang） 2, 雷源 2, 郑智胜 2, 佩里·J·布莱克舍 4, 郑戈洛 2
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MARCKS调节Rab10囊泡的膜靶向性以促进轴突发育

徐晓慧等。 单元格Res. 2014年5月.

摘要

轴突的发育需要从细胞内供应中添加膜，这已被证明由Rab10-阳性的质膜前体小泡（PPV）介导。然而，PPV膜转运过程的分子机制尚不清楚。在这里，我们表明肉豆蔻酰化丙氨酸富含C激酶底物（MARCKS）介导Rab10-阳性PPV的膜靶向性，这种调控对轴突发育至关重要。我们发现，Rab10的GTP-锁定活性形式与膜相关MARCKS结合，其亲和力取决于MARC KS效应域的磷酸化状态。MARCKS的基因沉默或其与Rab10相互作用的中断都会抑制皮层神经元的轴突生长，破坏Rab10小泡与质膜的对接和融合，从而导致对胞外轴突生长因子反应的轴突受体的膜插入丢失。因此，本研究确定了MARCKS在轴突发育过程中介导PPV膜靶向性的新功能。

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图1
图1
Rab10与MARCKS互动。（A）Rab10和MARCKS在大鼠脑不同发育阶段的表达。（B）,C）P0大鼠脑匀浆中Rab10和MARCKS的共免疫沉淀（Co-IP）。（D）用不同浓度的OA处理DIV2的皮层神经元6小时。细胞裂解物用抗MARCKS或磷酸化MACKS抗体进行免疫印迹（IB），以GAPDH或肌动蛋白作为负荷控制。（E）用OA（100 nM，6 h）或DIV2载体处理的培养皮层神经元的细胞裂解物，用连接到GST-Rab10或GST的谷胱甘肽-硫粒进行下拉，然后用带有MARCKS抗体的IB进行下拉。（F）将转染GFP-MARCKS的HEK293细胞用OA（100 nM）或载体处理6 h。将细胞裂解物用连接到GST-Rab10或GST的谷胱甘肽-硫粒下拉。结合蛋白受到带有指示抗体的IB。（G）用DMSO、DES（100 nM）或OA（100 nM）处理大鼠成纤维细胞2小时，然后固定（4%PFA）并用0.2%皂苷渗透，然后用PIP2（绿色）、MARCKS（蓝色）和Rab10（红色）抗体染色。比例尺，15μm。（H）将转染有GFP标记的各种MARCKS构建物的HEK293细胞的细胞裂解液与GST-Rab10（5μg）偶联的谷胱甘肽-硫粒进行下拉，然后用带有GFP或GST抗体的IB进行下拉。（一）MARCKS全长蛋白质或结构域的示意结构。ED，效应器域。（J）用HA-Rab10和YFP标记的MARCKS结构域共转染HEK293细胞的细胞裂解物进行IP和抗HA抗体，然后用IB和抗HA或GFP抗体。（K）GST-Rab10下拉HEK293细胞中表达的MARCKS结构域。（一）,M）将固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上的GST-Rab10与纯化的His6-MARCKS或His6-D3孵育。结合蛋白受到带有指示抗体的IB的影响。（N）使用预先加载GTPγS或GDP的纯化GST-Rab10（2μg）来降低His6-D3。（O）纯化的GST-MARCKS被用于拉下预先加载GTPγS或GDP的His6-Rab10。（P,问题）用所示结构转染的HEK293细胞的裂解液接受带有所示抗体的IP和IB。（右）在HEK293细胞中表达的Rab10（WT或Q68L形式）的GST-D3下拉。
图2
图2
MARCKS对轴突发育很重要。（A）将pSUPER载体或编码抗MARCKS siRNA的pSUPER载体或加扰序列（siScramblee）与MARCKS一起转染皮层神经元雷斯.内源性MARCKS和MARCKS雷斯用抗MARCKS或GFP抗体分别用IB分析水平。以肌动蛋白和矢量编码的GFP作为对照。（B）将EGFP、siScrambles或siMARCKS单独或与MARCKS一起转染分离的皮层神经元雷斯在DIV3，固定培养物并分析轴突长度。比例尺，20μm。（C）标准化轴突长度的量化。数据显示为平均值±SEM。对来自三个独立实验的至少80个神经元进行了分析。***P（P）<0.001，单因素方差分析。（D）转染siScramble或siMARCKS的DIV3皮层神经元用抗JIP1和Tuj1抗体染色。注意JIP1在轴突尖端的特定位置（红色箭头）。比例尺，20μm。（E）用各种质粒组合转染分离的皮层神经元，然后在DIV3用Smi312和Tuj1染色。比例尺，20μm。（F）标准化轴突长度的量化。数据显示为平均值±SEM。对来自三个独立实验的至少80个神经元进行了分析。***P（P）<0.001，单因素方差分析。（G,H）用编码siScramble或siMARCKS的质粒和pCAG-EYFP对E16.5电穿孔的大鼠胚胎P2新皮质切片进行轴突发育分析。Smi312用于标记轴突束。扩大的区域表示轴突束穿过中间区（IZ）。这些轴突束的长度用虚线画出，描绘了轴突束在IZ中的路径，并用对照组的标准值1.0进行了量化（H）数据以平均值±SEM表示。每组至少分析四只动物。**P（P）<0.01，学生的t吨-测试。比例尺，500μm。
图3
图3
MARCKS与Rab10的相互作用对轴突发育很重要。（A）在HEK293细胞中表达的D3阻断了Rab10和MARCKS之间的联系。（B）,C）转染载体质粒或编码MARCKS D1或D3片段的DIV3皮层神经元的代表性图像（B）轴突长度的量化（C）数据显示为平均值±SEM。对来自三个独立实验的至少100个神经元进行了分析。***P（P）<0.001，单因素方差分析。比例尺，20μm。（D）转染载体质粒或编码D3片段的DIV3皮层神经元用抗JIP1和Tuj1抗体染色。箭头表示轴突尖端的JIP1信号。比例尺，20μm。（E）,F）在E16.5处用载体或D3质粒以及pCAG-EYFP电穿孔的大鼠胚胎P2新皮质切片的代表性图像（E）胼胝体轴突长度的量化（F）数据以平均值±SEM表示。每组至少分析五只动物。**P（P）<0.01，学生的t吨-测试。比例尺，500μm。
图4
图4
MARCKS与Rab10的相互作用对囊泡对接和融合非常重要。（A）TIRFM分析用所示质粒转染的大鼠成纤维细胞中单个TD-Rab10囊泡的融合模式。单个融合事件用黄色箭头进行编号和指示。右栏是TD-Rab10囊泡（左图中的箭头）的荧光强度随时间的变化。注意，在100 s的观察期内，与D3细胞PM相关的Rab10信号持续存在。停靠和融合分别用红色箭头和绿色箭头表示。比例尺，10μm。（B）,C）用所示质粒转染的每个细胞，在5分钟的观察时间内，通过完整的对接和融合循环，量化融合事件的平均数量。数据以平均值±SEM表示。每组至少分析八个细胞。**P（P）< 0.01,***P（P）<0.001，不显著，学生t吨-测试。（D）每25μm TD-Rab10囊泡的平均数量2固定单元格中。表观荧光（epi-F）和TIRF信号分别代表总Rab10和PM-相关Rab10。数据以平均值±SEM表示。每组至少分析八个细胞。**P（P）< 0.01,***P（P）<0.001，无显著性，单向方差分析。（E）量化指定组中融合事件的平均数量。数据以平均值±SEM表示。每组至少分析八个细胞。**P（P）< 0.01,***P（P）<0.001，单因素方差分析。（F）,G）EM分析P0大鼠脑胼胝体区MARCKS和Rab10的亚细胞定位。箭头表示与PPV样囊泡相关的Rab10信号的免疫金颗粒（12 nm），箭头表示PM上MARCKS的免疫金粒子（18 nm）（F）。比例尺，200纳米。量化Rab10和MARCKS定位（G）。每组至少分析30个切片。（H）,一）定量转染所示质粒的大鼠成纤维细胞中Rab10囊泡从对接到融合的持续时间。每组至少分析10个细胞。***P（P）<0.001，学生t吨-测试。（J）免疫电镜分析转染载体或D3质粒的成纤维细胞中Rab10-阳性囊泡的亚细胞定位。黄色箭头指向Rab10的免疫金。红色箭头表示一个椭圆形Rab10-阳性结构。注意，在D3转染细胞中，Rab10-阳性小泡积聚在细胞外围。比例尺，200 nm。（K）量化距PM 200 nm处、PM 2μm长度上或以下的累积囊泡数量。数据以平均值±SEM表示。每组至少分析8个细胞。***P（P）<0.001，学生t吨-测试。
图5
图5
MARCKS对Rab10小泡在初级神经元中的膜插入很重要。（A）BODIPY-神经酰胺标记和观察程序示意图。（B）,C）用编码siMARCKS或扰乱序列的载体转染的皮层神经元用DIV2的BODIPY神经酰胺标记。用活体成像荧光显微镜记录最长突起BODIPY红信号的变化。每组至少分析五个细胞。*P（P）<0.05，成对t吨-测试。比例尺，20μm。（D）用TD-Rab10和pEYFP-N1（对照）、MARCKS-D3-YFP或编码siMARCKS的pSUPER载体共同转染皮层神经元。表观荧光（epi-F）和TIRF信号分别代表总TD-Rab10和PM-相关TD-Rab10。比例尺，25μm。（E）转染TD-Rab10和各种质粒的DIV2皮层神经元轴突生长锥中Rab10 TIRF信号的实时成像。所示为代表性图像。箭头指向聚变事件。比例尺，10μm。（F）TIRF信号相对于epi-F信号的量化。对照组的平均值标准化为1.0。数据以平均值±SEM表示。分析每组10个神经元。**P（P）< 0.01,***P（P）<0.001，单因素方差分析。（G）量化轴突生长锥中囊泡融合的频率。数据以平均值±SEM表示。分析每组10个神经元。**P（P）<0.01，单因素方差分析。（H）延时图像快照显示了转染siScramble或siMARCKS的DIV3神经元轴突生长锥中TD-Rab10小泡的运动。注意控制细胞轴突尖端运输小泡的褪色和siMARCKS细胞持续或逆行运输（红色箭头）。比例尺，10μm。另请参阅补充信息，电影S6和S7。
图6
图6
肌动蛋白动力学和MARCKS在轴突发育和Rab10囊泡融合中的协调。（A）将转染载体质粒siMARCKS或MARCKS-D3的神经元连同GFP，在DIV2处用DMSO或1μM细胞松弛素D处理24小时。在DIV3处，用Smi312和Alexa 647标记的指骨苷对培养物进行染色。比例尺，20μm。红色箭头表示轴突尖端的类阴茎激素信号。（B）生长锥处归一化类阴茎激素强度的量化。数据以每组20个神经元的平均值±SEM表示。***P（P）<0.001，学生t吨-测试。（C）轴突总长度的量化。数据显示为平均值±SEM。对来自两个独立实验的至少180个神经元进行了分析。*P（P）< 0.05,***P（P）<0.001，与学生的方差分析t吨-测试。（D）量化转染有指定质粒的成纤维细胞在5分钟观察时间内完成对接和融合循环的融合事件平均数，不使用或使用细胞松弛素D治疗（1μM，1 h）。数据以每组9个细胞的平均值±SEM表示。*P（P）< 0.05,***P（P）<0.001，学生t吨-测试。
图7
图7
MARCKS在IGFR或TrkB表面表达中的作用。（A）,D）分离的皮层神经元与GFP-IGFR联合转染（A）或标志TrkB（D）与siMARCKS或D3或载体质粒一起。在DIV3，用FLAG或GFP抗体对细胞进行活染色，以分别显示TrkB或IGFR的表面水平。表面标记后，穿透细胞并染色总IGFR或TrkB。比例尺，20μm。（B）,C类,E类,F）IGFR表面水平的量化（B）,C）或TrkB（E）,F）在所指示的组中。数据以平均值±SEM表示，对照组的值标准化为1.0。***P（P）< 0.01 (n个=每组10人），学生t吨-测试。
图8
图8
Rab10囊泡膜靶向模型。膜相关MARCKS与Rab10的GTP-结合形式相互作用，其方式依赖于MARCKS效应域的磷酸化状态，并介导Rab10-阳性PPV的膜靶向性。这一过程可能与细胞骨架动力学相协调。
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