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.2014年2月13日；156(4):786-99.
doi:10.1016/j.cell.2014.01.024。

通过TSC2的溶酶体补充调节TORC1对氨基酸饥饿的反应

康斯坦丁诺斯·德米特里亚德斯 1, 尼古拉斯·杜姆帕斯 2, 奥雷里奥A Teleman 三
附属公司

通过TSC2的溶酶体补充调节TORC1对氨基酸饥饿的反应

君士坦丁诺·德米特里亚德斯等。 单元格. .

摘要

TOR复合物1（TORC1）是一种有效的细胞生长和代谢合成代谢调节剂。当细胞有足够的氨基酸时，TORC1通过Rag GTPases介导的溶酶体定位而激活。氨基酸去除后，Rag GTPases释放TORC1，使其成为细胞质且不活跃。我们在这里显示，在氨基酸去除后，Rag GTPases还将TSC2募集到溶酶体，在那里它可以作用于Rheb。只有当Rag GTP酶和Rheb都不活跃时，TORC1才能从溶酶体中完全释放。在氨基酸提取后，缺乏TSC2的细胞无法从溶酶体中完全释放TORC1，无法完全灭活TORC1并在生理上无法适应氨基酸饥饿。这些数据表明，TSC2亚细胞定位的调节可能是控制其活性并将TSC2置于TORC1的氨基酸感应途径中的一般机制。

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数字

图1
图1。TSC2与Rag GTPase复合物的保守结合
（A）果蝇属氨基酸提取后，Rag蛋白需要完全灭活TORC1。用针对LacZ（对照）、RagA或RagC的dsRNAs处理的S2细胞的免疫印迹，在含有透析血清的仅缺乏氨基酸的培养基中培养指定时间。（B） 枪质谱分析确定Tsc2为Rag结合蛋白。来自S2细胞的两个独立的FLAG-RagA+FLAG-Rag C免疫沉淀物（IP）的Tsc2和控制蛋白的肽丰度有两个统计数据。（C） 通过coIP证实Rag蛋白与Tsc2结合，但不是与之无关的蛋白Medea。抗FLAG IP的免疫印迹果蝇属如图所示，S2细胞表达FLAG标记的RagA+RagC和V5标记的Tsc2或Medea。（D） 人TSC2结合人Rag二聚体复合物。如图所示，来自表达FLAG标记TSC2和HA-GST标记Rag蛋白或HA-GST对照的HEK293FT细胞的抗FLAG IP的免疫印迹。
图2
图2。TSC2与Rag蛋白的结合依赖于细胞氨基酸信号
（A） 面板B-D中用于描绘TSC2和RagA之间结合界面的RagA、RagB和各种变体的示意图。（B） RagA的N端和C端区域都参与TSC2结合。如图A所示，FLAG-TSC2与RagA、RagB的CoIP以及这两种蛋白质的杂交版本，表明N-末端33个氨基酸以及RagA特有的5个C-末端氨基酸都会影响TSC2结合。（C） 如图A所示，RagA的所有五个C末端氨基酸都有助于TSC2结合，因为每一个氨基酸单独引入时都能提高RagB与TSC2的结合。CoIP实验如（B）所示。（D） TSC2的N末端424个氨基酸与Rag蛋白强烈结合，尽管剩余的氨基酸425-1784也有助于Rag结合。带有HA-RagA+C的截断版本FLAG-TSC2的HEK293FT细胞中的CoIP。“非活动”-锁定RagA低核苷酸和RagC全球技术伙伴如图F（E）所示，氨基酸饥饿增加了内源性TSC2与Rag GTPases的结合。表达FLAG标记的RagA+RagC的HEK293FT细胞的抗FLAG IP的免疫印迹，在透析的FBS存在下处理+/-氨基酸1h。（F） 内源性TSC2和TSC1在“非活性”状态下与Rag二聚体结合最强，这与猛禽结合相反。表达FLAG-tagged WT-RagA+RagC的HEK293FT细胞中抗FLAG-IP的免疫印迹以及锁定在活性RagA中的突变体全球技术伙伴/RagC公司低核苷酸或不活动的RagA低核苷酸/RagC公司全球技术伙伴状态。
图3
图3。氨基酸饥饿导致TSC2溶酶体以Rag依赖方式定位
（A，C）TSC2在氨基酸缺失时积聚在溶酶体上。HEK293FT细胞（A）或MEFs（C）在透析FBS存在下处理+/-所有氨基酸达指定时间的共聚焦显微照片，TSC2（绿色）和溶酶体标记LAMP2（红色）染色。LAMP2骨料在+aa条件下不显示TSC2积累。（B） TSC2在氨基酸读取后迅速从溶酶体中重新定位。HEK293FT细胞在透析血清中饥饿氨基酸4h，然后重新供应氨基酸培养基5分钟。细胞染色并成像，如（A）所示。
图4
图4。TSC2的溶酶体募集依赖于Rag蛋白
氨基酸去除后TSC2的（A-A'）溶酶体定位需要LAMTOR复合物。p14/LAMTOR2敲除MEF（A）或重组为表达EGFP-p14融合（A'）的对照p14敲除MEFs的共焦显微照片，在透析的FBS中处理+/-氨基酸1h。溶酶体标记有抗LAMP2抗体或溶酶体定位的EGFP-p14。（B） 氨基酸去除后TSC2的溶酶体定位需要Rag蛋白。转染对照siRNA的MEF雷尼利亚靶向各种Rag蛋白的荧光素酶或siRNA，在透析的FBS存在下处理+/-氨基酸1h。细胞染色和成像如（A）所示。（C） 氨基酸去除后TSC2的溶酶体定位要求Rag蛋白改变为非活性构象。转染对照siRNA或靶向GATOR1复合物DEPDC5、NPRL2或NPRL3组分的siRNA的MEF，Rag蛋白在氨基酸去除后变得不活跃。细胞染色并成像，如（A）所示。
图5
图5。TSC2损失导致对氨基酸去除不敏感果蝇属和哺乳动物细胞
（A-B）Tsc2但非PTEN击倒果蝇属对氨基酸去除基本不敏感的细胞。（A） 免疫印迹果蝇属不含dsRNA、抗GFP的dsRNA（对照）或抗Tsc2的dsRNA处理的S2细胞，用含有（+）或缺乏氨基酸的培养基处理指定时间。（B） PTEN击倒S2细胞可在氨基酸去除后有效灭活TORC1，尽管开始时TORC1活性水平升高。（C-D）TSC2敲除MEFs在氨基酸退出后不能完全关闭TORC1，而PTEN敲除MEF可以。（C）TSC2的免疫印迹−/−和相应的控制TSC2+/+MEF或（D）PTEN敲除MEF，用中等+/-氨基酸处理指定时间。通道6和12（C），在氨基酸（“Rapa”）存在下，细胞处理+20nM雷帕霉素1h。使用LI-COR成像系统进行量化。
图6
图6。在以依赖Rheb的方式去除氨基酸后，mTOR需要TSC2才能定位在远离溶酶体的位置
（A-B）mTOR在对照（A）中的氨基酸去除时从溶酶体释放，而不是TSC2缺失的MEF（A’）。这可以通过重新表达TSC2+EGFP（标记转染细胞）而不是在TSC-null MEF（B）中单独表达EGFP来挽救。请注意，表达TSC2和GFP的细胞不再在溶酶体上积累mTOR，而周围未转染的细胞保留溶酶体定位的mTOR。（C） 在TSC2缺失的MEFs中氨基酸退出时，mTOR从溶酶体的缺陷释放通过敲低Rheb来挽救。TSC2-转染Rheb siRNAs（上面板）或对照siRNA（下面板）的完整MEF，在透析FBS存在下，用含有+/-氨基酸的培养基处理1h。
图7
图7。TSC2空细胞对氨基酸饥饿的反应受损，导致死亡
（A-B）氨基酸去除导致TSC2无效细胞的细胞死亡。TSC2系统−/−和相应的TSC2+/+第1天，在透析的FBS存在下，用培养基+/-氨基酸处理对照MEF。第4天，给所有样品提供含有氨基酸的新鲜培养基。（A） 第1天、第4天和第7天拍摄的DIC图像。（B） 使用Cell-Titer-Glo试剂盒（Promega）测定细胞活力。（C） TSC2-null MEF在氨基酸提取后显示出缺陷的自噬诱导。TSC2系统−/−和相应的TSC2+/+对照MEF用含有（+）或缺乏氨基酸的培养基在透析FBS存在下处理指定时间。免疫印迹显示自噬激活通过LC3A向更快迁移的脂溶性II型转化的增加和p62蛋白的降解。（D-E）TORC1的药理学抑制可在氨基酸退出后挽救TSC2-null MEF的存活。TSC2系统−/−用含有或不含20nM雷帕霉素（−aa/+Rapa）的（+aa）或缺乏（−aa）氨基酸的培养基处理小鼠胚胎成纤维细胞3天，同时使用透析的FBS.DIC图像（D）和使用cell-Titer-Glo试剂盒（Promega）（E）测定的各细胞活性滴度。错误栏：标准偏差。
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中的注释

  • mTORC1：关闭与打开同样重要。
    Benjamin D，明尼苏达州霍尔。 Benjamin D等人。 单元格。2014年2月13日；156(4):627-8. doi:10.1016/j.cell.2014.01.057。 单元格。2014 PMID：24529368

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