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。2014年6月；25(6):1237-54.
doi:10.1681/ASN.2013070810。 Epub 2014年2月7日。

NADPH氧化酶nox4的基因靶向或药物抑制对长期糖尿病肾病的肾脏保护作用

杰伊·C·贾 1, 史蒂芬·P·格雷 2, 大卫·巴里特 2, Jun Okabe先生 三, 阿萨姆埃尔奥斯塔 三, Tamehachi Namikoshi 4, 维奇·塔拉斯·邦克 2, 柯斯汀·温格勒 5, 塞德里克·辛德拉莱维兹（Cedric Szyndralewiez） 6, 弗雷迪·海茨 6, 瑞安·图伊兹 7, 马克·E·库珀 1, 哈拉尔德·H·H·W·施密特 5, 卡琳·贾德利特·达姆 8
附属公司

NADPH氧化酶nox4的基因靶向或药物抑制对长期糖尿病肾病的肾脏保护作用

杰伊·C·贾等。 J Am Soc肾病。 2014年6月。

摘要

糖尿病肾病可能发生，部分原因是肾内氧化应激。NADPH氧化酶包括唯一已知的专用活性氧（ROS）形成酶家族。在啮齿类动物肾脏中，NADPH氧化酶催化亚单位的三种亚型（Nox1、Nox2和Nox4）被表达。在ApoE（-/-）小鼠链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠模型中，Nox4是肾脏ROS的主要来源。Nox4的缺失，而Nox1的缺失，导致肾脏免受肾小球损伤，表现为蛋白尿减少，结构保持，肾小球细胞外基质蛋白积聚减少，肾小球巨噬细胞浸润减弱，以及降低链脲佐菌素诱导的糖尿病ApoE（-/-）小鼠的单核细胞趋化蛋白-1和NF-κB的肾脏表达。重要的是，给予最特异的Nox1/4抑制剂GKT137831，可以复制Nox4缺失的肾保护作用。在人类足细胞中，Nox4基因的沉默导致ROS的生成减少，并下调与糖尿病肾病相关的促炎和促纤维化标记物。总之，这些结果确定了Nox4是导致糖尿病肾损伤的活性氧的关键来源，并为创新的小分子方法治疗和/或预防慢性肾衰竭提供了原理证明。

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数字

图1。
图1。
Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制可减轻糖尿病患者糖尿病引起的蛋白尿增加阿波（ApoE）−/−老鼠。对照组和糖尿病患者的尿白蛋白排泄（A–C）和ACR（D–F）第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和D），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B和E），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831（C和F）治疗10周和20周的小鼠(n个=每组10–15人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.01与各自的对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和D），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B和E），或对照组阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C和F）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A和D）或糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（C和F）。ACR，白蛋白/肌酐比值；控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图2。
图2。
Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制可减轻糖尿病患者肾小球损伤阿波（ApoE）−/−老鼠。对照组和糖尿病组的肾小球硬化指数（A）和系膜面积扩张（B）第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠(n个=每组7–8人）。对照组和糖尿病组的肾小球硬化指数（C）和系膜面积扩张（D）1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠(n个=每组7–8人）。对照组和糖尿病ApoE患者的肾小球硬化指数（E）和系膜面积扩张（F）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠(n个=每组7–8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.01与各自的对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和B），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号-/年阿波（ApoE）−/−小鼠（C和D），或对照组阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（E和F）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A和B）或糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（E和F）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图3。
图3。
Nox4基因缺陷，而Nox1基因缺陷，以及药物Nox抑制减弱糖尿病肾小球中增加的IV型胶原积聚阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球IV型胶原的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图4。
图4。
糖尿病肾小球中Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制减弱了纤维连接蛋白积累的增加阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球纤维连接蛋白的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号-/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图5。
图5。
Nox4基因缺陷和药物Nox抑制减弱糖尿病肾小球VEGF表达增加阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球VEGF的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A）、对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（B）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（B）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） ；‡P（P）=0.08与糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（B）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图6。
图6。
Nox4（而非Nox1）基因缺陷和药物Nox抑制减弱糖尿病肾小球中硝基酪氨酸的积累阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球中硝基酪氨酸的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（A），对照组和糖尿病组1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。结果表示为相对于对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照组（未经治疗）阿波（ApoE）−/−小鼠（C），其被任意指定值为1。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图7。
图7。
糖尿病患者中Nox4基因缺陷而非Nox1基因缺陷，以及药物Nox抑制减弱了肾脏超氧化物和活性氧的形成阿波（ApoE）−/−老鼠。对照组和糖尿病组肾皮质（A、C和E）中的超氧化物生成和肾皮质（B、D和F）细胞溶质和线粒体部分中的活性氧生成第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A和B）、对照组和糖尿病患者1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（C和D），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（E和F）(n个=每组5-6人）。超氧化物数据（A、C和E）显示为2HE（纳米）与DHE（微米）的比值。关于ROS测量，结果是相对于对照组表达的第4个+/+阿波（ApoE）−/−小鼠（B），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−小鼠（D）或对照组（未经治疗）阿波（ApoE）−/−小鼠（F），任意指定值100。数据为平均值±SEM*P（P）≤0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−或控制1号+/年阿波（ApoE）−/−小鼠或对照阿波（ApoE）−/−老鼠；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−老鼠。2HE，2氢乙炔；控制；糖尿病；二氢乙硫醚；GKT，GKT137831；RLU，相对光单位。
图8。
图8。
Nox4基因缺陷而非Nox1基因缺陷以及药物Nox抑制可减轻糖尿病肾小球巨噬细胞浸润阿波（ApoE）−/−老鼠。正常人和糖尿病患者肾小球F4/80的免疫染色第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A）或对照组和糖尿病小鼠1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后的小鼠（B），或对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−给予和不给予GKT137831治疗20周的小鼠（C）(n个=每组6-8人）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（A），对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号-/年阿波（ApoE）−/−小鼠（B）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加上GKT137831小鼠（C）；#P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−（A） 或糖尿病患者阿波（ApoE）−/−小鼠（C）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831。
图9。
图9。
沉默Nox4可以降低高糖以及高糖和TGF-β1介导的ROS形成和人类足细胞中纤维化前标志物的基因表达。（A） 在糖尿病刺激下，人足细胞中Nox4和Nox5，但Nox1、Nox2或p47phox mRNA水平没有上调。在NG（5 mM）或HG（25 mM）培养的分化人足细胞中以及在TGF存在或不存在的情况下，分析Nox亚型mRNA水平和细胞溶质调节因子p47phox-β1（5纳克/毫升，2天）。甘露醇（20 mM/L+5 mMD类-葡萄糖）用作渗透控制。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与NG相比；#P（P）与HG相比<0.05。（B和C）IV型胶原、纤维连接蛋白、VEGF和α-用Nox4特异性shRNA转染分化的人足细胞中的SMA，然后在NG（5 mM）或HG（25 mM）中生长2天（B和C）。ROS生成的结果表示为相对于非目标加NG，后者被任意赋值为100（B）。数据为平均值±SEM(n个=6/组）。∧P（P）<0.05与非目标加NG相比；§P（P）<0.05与非目标加HG相比。（D和E）IV型胶原、纤维连接蛋白、VEGF和α-用Nox4特异性shRNA转染分化的人足细胞中的SMA，然后在有或无TGF的情况下生长-β1（5 ng/ml），ROS生成（D）4小时，RT-PCR（E）2天。数据为平均值±SEM(n个=6/组）。†P（P）<0.05与非目标，‡P（P）<0.05与非靶向加TGF-β1.HG、高糖；NG，正常葡萄糖；RLU，相对光单位。
图10。
图10。
抑制Nox改善TGF-β1诱导人足细胞中ROS的生成和纤维化前标志物的基因表达。（A） 抑制Nox改善TGF-β1–诱导人足细胞产生ROS。经GKT137831（10µM） 在有无TGF的情况下持续2小时-β1（5 ng/ml）持续4小时。DMSO用作车辆控制。结果是相对于控件表示的，控件被任意赋值为100。（B） 抑制Nox可降低高糖和TGF-β1-诱导IV型胶原、纤连蛋白、CTGF、VEGF和α-人足细胞中的SMA。在使用和不使用GKT137831（10µM） 在TGF存在或不存在的情况下持续2小时-β1（5 ng/ml），持续2天。DMSO用作车辆控制。数据为平均值±SEM(n个=每组6人）*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）与转化生长因子相比<0.05-β1.COL4，IV型胶原；结缔组织生长因子；GKT，GKT137831；RLU，相对光单位。
图11。
图11。
Nox4基因靶向减轻糖尿病诱导的促炎症标记物MCP-1和NF表达增加-κB第65页在体外和体内（A和B）（A）MCP-1和（B）NF的RT-PCR分析-κ用Nox4特异性shRNA转染人足细胞中的B p65，然后在NG（5 mM）或HG（25 mM）中生长2天。数据为平均值±SEM(n个=6/组）*P（P）<0.05与非目标加NG相比；#P（P）<0.01与非目标加HG相比。（C）MCP-1和（D）NF的（C和D）RT-PCR分析-κ对照组和糖尿病组肾皮质中的B p65第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−20周后。数据为平均值±SEM(n个=6/组）^P（P）<0.05与对照组第4个+/+阿波（ApoE）−/−；§P（P）<0.05与糖尿病第4个+/+阿波（ApoE）−/−老鼠。（E和F）ELISA法测定（E）对照组和糖尿病患者肾皮质蛋白提取物中MCP-1第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠或（F）对照组和糖尿病患者1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−20周后(n个=5-6/组）或（G）对照组和糖尿病组阿波（ApoE）−/−使用或不使用GKT137831号持续20周(n个=5–6/组）。数据为平均值±SEM。†P（P）<0.05与各自对照第4个+/+阿波（ApoE）−/−和第4个−/−阿波（ApoE）−/−小鼠（E）或对照1号+/年阿波（ApoE）−/−和1号−/年阿波（ApoE）−/−小鼠（F）或对照阿波（ApoE）−/−和阿波（ApoE）−/−加GKT137831小鼠（G）；‡P（P）<0.05与糖尿病阿波（ApoE）−/−小鼠（G）。控制；糖尿病；GKT，GKT137831；HG，高糖；NG，正常葡萄糖。
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