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.2014年2月14日；114(4):626-36.
doi:10.1161/CIRCRESAHA.114302562。 Epub 2013年12月23日。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子-1在出生后心脏生长期间线粒体动力学控制中的作用

奥拉·J·马丁 1, 凌来, 曼加拉M Soundarapandian, 特蕾莎·C·利昂, 安东尼奥·佐扎诺, 马克·P·凯勒, 艾伦·D·阿蒂, Deborah M Muoio女士, 丹尼尔·普·凯利
附属公司

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子-1在出生后心脏生长期间线粒体动力学控制中的作用

奥拉·J·马丁等。 循环研究. .

摘要

理论基础：越来越多的证据表明，适当控制线粒体动力学（融合和裂变）是心脏高容量ATP生成所必需的。转录辅激活物，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物-1（PGC-1）α和PGC-1β，已被证明在出生时调节心脏线粒体的生物生成。PGC-1辅活化子在出生后心脏中的功能尚未完全了解。

目标：我们的目的是评估PGC-1辅激活物在小鼠出生后心脏发育和成年心脏中的作用。

方法和结果：在小鼠中使用条件基因靶向研究PGC-1辅激活物在出生后心脏发育和成年心脏中的作用。在PGC-1α/β缺陷小鼠出生后的发育过程中，观察到明显的线粒体结构紊乱，包括断裂和伸长，与致命性心肌病的发生有关。PGC-1α/β缺陷小鼠心脏线粒体融合（Mfn1，Opa1）和分裂（Drp1，Fis1）相关基因的表达发生改变。PGC-1α通过协同激活保守DNA元件上的雌激素相关受体α，直接调节Mfn1基因转录。令人惊讶的是，成人心脏中PGC-1α/β缺乏并未导致线粒体动力学异常或心力衰竭。然而，转录谱分析表明，PGC-1辅激活子是成年心脏线粒体动力学和能量转导中核和线粒体编码基因高水平表达所必需的。

结论：这些结果揭示了心脏线粒体动力学中不同发育阶段的特异性程序。

关键词：Mfn1蛋白，人；心肌病；线粒体动力学。

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数字

图1
图1。前列腺素C-1α−/−βf/f/MCK-Cre公司小鼠发生进行性产后心肌病
（A）监测雄性和雌性小鼠20周[PGC-1β飞行/飞行(αβ+/+，n=12），PGC-1α−/−β飞行/飞行(α−/−，n=10），前列腺素C-1βf/f/MCK Cre公司(β−/−，n=10）和PGC-1α−/−βf/f/MCK-Cre公司(αβ−/−，n=21）]。图表表示存活率与年龄的关系（基于对数秩检验，p<0.0001）。男性与女性αβ的寿命没有显著差异−/−老鼠。（B）用超声心动图测定1周、4周和8周龄小鼠的左心室（LV）缩短分数（FS）。1周龄的数据代表雄性和雌性小鼠，每个基因型n=4-12只小鼠。4周龄和8周龄的数据代表雌性小鼠，每个基因型n=6-12只小鼠*相对于αβ，p<0.05+/+.（C）1周龄、4周龄和8周龄αβ的典型M型超声心动图+/+和αβ−/−展示的是老鼠。（D）1周龄、4周龄和8周龄PGC-1αβ心肌切片梅森三色染色的代表性图像+/+和PGC-1αβ−/−展示的是老鼠。比例尺为100μm。
图2
图2。在PGC-1α中发生进行性心肌线粒体结构和功能紊乱−/−βf/f/MCK-Cre公司老鼠
（A）出生当天（DOB）从动物左心室游离壁上拍摄的典型电子显微图像。低倍图像用于评估线粒体密度，高倍图像用于确定线粒体结构。对每个基因型的4只动物的图像进行了检查。比例尺为1μm。（B）显示了来自所示基因型的1周龄小鼠左心室游离壁和4周龄和8周龄小鼠乳头肌的代表性EM。箭头表示线粒体结构异常，包括嵴结构异常的线粒体（黑箭头）、细长的线粒体（黑色箭头）、“圆环状”的线粒体（白色箭头）和小块的线粒体（白箭头）。（C）PGC-1β心脏DNA的PCR飞行/飞行(αβ+/+)与PGC-1α−/−βf/f/MCK-Cre公司(αβ−/−)用NADH脱氢酶（ND1）引物定量小鼠线粒体DNA，用脂蛋白脂肪酶（LPL）引物将其归一化为基因组DNA。ND1水平归一化为基因组DNA含量。条形代表平均值±SEM。*p<0.05。（D）条形图代表从所示基因型的4周龄雌性小鼠的整个心室分离的线粒体上测定的平均（±SEM）线粒体呼吸率。使用基于荧光的氧气传感探针（FOXY，Ocean Optics），以丙酮酸或棕榈酰肉碱为底物，在以下条件下测量速率：基础状态3（ADP刺激）和寡霉素诱导状态4（oligo）*相对于αβ，p<0.05+/+.
图2
图2。在PGC-1α中发生进行性心肌线粒体结构和功能紊乱−/−βf/f/MCK-Cre公司老鼠
（A）出生当天（DOB）从动物左心室游离壁上拍摄的典型电子显微图像。低倍图像用于评估线粒体密度，高倍图像用于确定线粒体结构。对每个基因型的4只动物的图像进行了检查。比例尺为1μm。（B）显示了来自所示基因型的1周龄小鼠左心室游离壁和4周龄和8周龄小鼠乳头肌的代表性EM。箭头表示线粒体结构异常，包括嵴结构异常的线粒体（黑箭头）、细长的线粒体（黑色箭头）、“圆环状”的线粒体（白色箭头）和小块的线粒体（白箭头）。（C）PGC-1β心脏DNA的PCR飞行/飞行(αβ+/+)与PGC-1α−/−βf/f/MCK-Cre公司(αβ−/−)用NADH脱氢酶（ND1）引物定量小鼠线粒体DNA，用脂蛋白脂肪酶（LPL）引物将其归一化为基因组DNA。ND1水平归一化为基因组DNA含量。条形代表平均值±SEM。*p<0.05。（D）条形图表示从所示基因型的4周龄雌性小鼠的整个心室中分离的线粒体上测定的平均（±SEM）线粒体呼吸速率。使用基于荧光的氧气传感探针（FOXY，Ocean Optics），以丙酮酸或棕榈酰肉碱为底物，在以下条件下测量速率：基础状态3（ADP刺激）和寡霉素诱导状态4（oligo）*相对于αβ，p<0.05+/+.
图3
图3。PGC-1α线粒体动力学相关基因表达减少−/−βf/f/MCK-Cre公司(αβ−/−)心脏
（A）对从PGC-1β心脏分离的RNA进行qRT-PCR分析的结果飞行/飞行(αβ+/+)与PGC-1α−/−βf/f/MCK-Cre公司(αβ−/−)出生（0周）至8周龄的小鼠[mitofusin1(Mfn1型)，丝裂原融合蛋白2(Mfn2公司)，动力相关蛋白1(图纸1)，视神经萎缩1(Opa1公司)]. 显示了每组4只动物的平均结果*相对于相应的αβ，p<0.05+/+相对于相应基因型的第0周时间点，p＜0.05。（B）代表性的Western blot分析使用从1周龄和8周龄小鼠心室组织匀浆中制备的蛋白质提取物进行，该匀浆来自顶部所示的基因型。电压依赖性阴离子通道（VDAC）和S6核糖体蛋白（S6RP）用作负载对照。
图4
图4。诱导Mfn1公司和Mfn2公司PGC-1α和PGC-1β的表达
（A，顶部）进行qRT-PCR分析以量化Mfn1公司和Mfn2公司腺病毒介导的PGC-1α、PGC-1β或GFP对照过表达后NRCM中的转录物。条形图表示3个独立实验的平均值（±SEM），*相对于对照组，p<0.05。（底部）在H9c2肌管中腺病毒介导PGC-1α或β过度表达后，使用全细胞蛋白提取物进行典型的Western blot分析。（B）定量的qRT-PCR分析结果Mfn1公司和Mfn2公司shRNA-介导的PGC-1α和β基因敲除（KD）后NRCM中的转录物【shRNAs导致PGC-1β（67%）和α（84%）的显著KD】。条形代表3个独立实验的平均值（±SEM），*p<0.05。
图5
图5。PGC-1α共激活ERRα以增加Mfn1基因的转录
（A，左）在过度表达的PGC-1α（黑色条）或载体主干控制（pcDNA3.1；灰色条）存在的情况下，将序列缺失报告构建物转染到C2C12肌管。条形代表平均荧光素酶活性（归一化相对光单位，RLU）±SEM。灰色（-2826）或白色（+110）星表示推测ERR位点的位置*p<0.05。（右）推测ERRα结合共有位点序列。推测ERR结合位点的位置由恒星表示。方框中显示了物种之间的DNA序列保守性。（B）条形图表示Mfn1.Luc的RLU-2299/+70或Mfn1.Luc-在C3H10T1/2细胞中存在或不存在表达的PGC-1α和/或ERRα的情况下，2299/+492报告子*与单独报告者相比p<0.05。（C）在存在或不存在过表达PGC-1α和/或ERRα的情况下，用含有两个短核苷酸片段拷贝的报告构建物转染C3H10T1/2细胞，该短核苷酸片段包含TK启动子上游保守ERRα位点（或该位点的突变版本）。条形代表3个独立实验的平均归一化RLU±SEM*p<0.05。（D）如下图所示，在adPGC-1α或使用抗PGC-1β、抗ERRα或IgG（阴性对照）的对照病毒感染H9c2肌管后，对ChIP分析进行量化。图上方的示意图显示了用于扩增的引物的相对位置（黑色箭头），以及保守ERR-RE（白星）的相对位置。条形代表3个独立染色质分离和免疫沉淀的SYBR绿色定量（任意单位±SEM），归一化为IgG对照值（取1.0）*与IgG对照组相比，p<0.05。
图6
图6。成年PGC-1α心脏线粒体通路相关基因的整体下调−/−βf/f/MerCre公司老鼠
（A）成人代表EM(A类)前列腺素C-1α−/−βf/f/MerCre公司（α−/−)或PGC-1α−/−βf/f/MerCre公司(αβA类−/−)在IP注射他莫昔芬或对照2个月后，从4个月大雌性小鼠的乳头肌中取出心脏。图片代表每组3只动物。如图所示，比例尺为5μm或1mm。（B）Affymetrix基因芯片剖析数据的热图，表示2-3个月大的PGC-1α心脏组织中受调控线粒体通路内的基因−/−βf/f/MerCre公司小鼠，载药后1个月（α−/−)或他莫昔芬注射液（αβA类−/−)。基因是根据α之间差异表达（DE）的后验概率（PP）排序的−/−和αβA类−/−红色表示相对于α的上调，蓝色表示相对于α的下调−/−控制动物。右边的折线图显示了每个基因的PP值；红色表示PP>0.949。（C）条形图表示从2-3个月大的对照组PGC-1αβ的整个心室分离的线粒体上测定的线粒体平均呼吸速率（±SEM）+/+(αβ+/+)小鼠与PGC-1α−/−βf/f/MerCre公司(αβA类−/−)小鼠，注射载体或三苯氧胺1个月后（取决于基因型）。使用海马生物科学XF96分析仪以丙酮酸盐为底物，在以下条件下测量速率：基础状态3（ADP刺激）和寡霉素诱导状态4（寡）*相对于αβ，p<0.05+/+.（D）qRT-PCR分析用于量化2-3个月龄对照组PGC-1αβ心脏组织中编码裂变/融合蛋白的mRNA水平+/+(αβ+/+)，前列腺素C-1βf/f/MerCre公司(βA类−/−)，PGC-1α−/−(α−/−)，PGC-1α−/−(α−/−)，PGC-1α−/−βf/f/MerCre公司（αβA−/−)小鼠，注射载体或三苯氧胺1个月后（取决于基因型）。条形图代表平均值±SEM值*相对于αβ，p<0.05+/+.
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