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.2014年3月；63(3):283-95.
doi:10.1007/s00262-013-1513-8。 Epub 2013年12月22日。

大豆肽lunasin在淋巴瘤细胞因子免疫治疗中的作用

华晨畅 1, 大卫·刘易斯, 童钧毓, 凌寒, 莎拉·M·P·亨里克斯, 拉里·沃利斯, 伊凡·普·卢波夫, 大卫·佩洛索, 安东尼·L·辛, 凯伦·波洛克, 本·奥德卢门, 方丽, 珍妮斯·布鲁姆, 希瓦尼·斯利瓦斯塔瓦, 迈克尔·罗伯逊
附属公司

大豆肽lunasin在淋巴瘤细胞因子免疫治疗中的作用

华晨畅等。 癌症免疫疗法. 2014年3月.

摘要

免疫刺激细胞因子可以增强抗肿瘤免疫，是癌症治疗手段的一部分。我们以前曾报道过移植后淋巴瘤患者存在获得性信号转导子和转录激活子4缺陷，导致临床免疫治疗期间IFNγ产生缺陷。为了进一步改进基于细胞因子的免疫疗法，我们研究了一种名为lunasin的大豆肽对自然杀伤细胞（NK）的作用，该肽与细胞因子协同作用。在IL-12或IL-2存在的情况下，用或不用lunasin刺激健康献血者和移植后淋巴瘤患者的外周血单个核细胞。通过体外和体内肿瘤模型评估NK的活性，并评估其抑瘤活性。染色质免疫沉淀法用于评估由lunasin和细胞因子调节的基因位点的组蛋白修饰。在IL-12或IL-2刺激的NK细胞中添加lunasin，在诱导参与细胞毒性的IFNG和GZMB方面表现出协同作用。联合使用lunasin和细胞因子（IL-12加IL-2）能够恢复移植后淋巴瘤患者NK细胞产生IFNγ。此外，在体外和体内肿瘤模型中，用lunasin加细胞因子刺激的NK细胞显示出比单独用细胞因子刺激更高的杀瘤活性。lunasin对NK细胞影响的潜在机制可能是由于靶基因座的表观遗传学调节。Lunasin代表了一种不同类型的免疫调节剂，可以增强基于细胞因子的免疫疗法介导的治疗反应。

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没有。

数字

图1
图1
Lunasin刺激人类外周NK细胞。仅用培养基（−）、20μM（lu）的lunasin、10 ng/ml的细胞因子IL-12或100 U/ml的IL-2以及细胞因子+lunasin24小时刺激正常对照的外周血单个核细胞（PBMC）。lunasin肽由LifeTein（新泽西州南平原）化学合成。使用细胞内细胞因子染色分析单细胞水平的IFNγ的产生(一–电子). 在刺激的最后6小时，添加格列美托普（莫能菌素）以阻止IFNγ的分泌。用FITC-结合CD3和APC-结合CD56单克隆抗体对刺激的PBMC进行表面染色，清洗、固定和渗透。清洗后，用PE结合的抗IFNγ单克隆抗体培养细胞。用流式细胞术对5000例门控CD3阴性和CD56阳性NK细胞群体的IFNγ表达进行评估(一). 一位捐赠者的代表性点图显示了不同处理后产生IFNγ的NK人群的百分比(b条)，产生IFNγ的NK人群的平均百分比表示为来自5个不同正常供体的平均±SD(c（c）). 产生干扰素γ的NK细胞进一步分离为CD56明亮和CD56暗淡群体(d日)，并且产生干扰素γ的CD56明亮或CD56暗淡群体的百分比是来自与c（c）并表示为平均值±SD(电子).（f）用ELISA分析纯化NK细胞刺激后分泌IFNγ的情况。用CD56磁珠（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotec）进行阳性选择，从正常对照者的PBMC中分离出新的人类NK细胞，如b条。刺激1天后，对无细胞上清液进行IFNγ生成评估，并将数据表示为5个不同对照组的平均值±SD。克–我lunasin对人类NK细胞基因表达的影响。细胞颗粒收集自（f）在Trizol试剂中重新悬浮以提取总RNA。首先合成第一链cDNA，然后使用带有引物的Taqman分析进行实时qPCR克干扰素γ(IFNG公司),小时颗粒酶B(GZMB公司)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF或CSF2型)、和我转化生长因子β(TGFB1型)和转化生长因子β受体(TGFBR2型)ABI 7300（生命技术应用生物系统，加利福尼亚州卡尔斯巴德）。数据表示为5个不同对照组的平均值±SD*P（P） ≤ 0.05; **P（P） ≤ 0.01; ***P（P） ≤ 0.001
图2
图2
lunasin与细胞因子联合的剂量依赖性效应。如图所示，刺激从正常对照组（如图1f所示）PBMC中新分离的人类NK细胞，并在刺激一天后使用ELISA测定上清液中IFNγ的产生。一半最大有效浓度（EC50)使用Origin Program（马萨诸塞州北安普敦市OriginLab），根据与IL-12以10 ng/ml的浓度培养的NK产生IFNγ的剂量-反应曲线计算lunasin的含量。显示了一条基于IFNγ产生剂量响应的代表性曲线。欧盟委员会50表示为4个不同正常对照组的平均值±SD。b条分离的NK细胞，如一在5、20和80μM的不同浓度下，联合使用两种细胞因子（IL-2（10 U/ml）和IL-12（1 ng/ml））刺激。刺激后一天，用ELISA测定上清液中IFNγ的产生。数据表示为3个不同正常对照组的平均值±SD*P（P） ≤ 0.05
图3
图3
拯救淋巴瘤患者移植后NK细胞产生IFNγ。正常对照组和移植后淋巴瘤患者的PBMC仅用培养基（−）、IL-12（10 ng/ml）和IL-2（100 U/ml），IL-12和IL-2加lunasin（lu，20μM）刺激，或单独使用lunasin1天。如图1a所示，使用细胞内细胞因子染色分析单细胞水平的IFNγ的产生，一名对照组和患者的代表性点图如所示一IFNγ阳性NK人群的百分比（CD3阴性和CD56阳性）表示为6名正常对照组和5名患者（1名患者在移植后6-12个月和4名患者在术后3-6个月）的平均±SD(b条). *P（P） ≤ 0.05
图4
图4
lunasin对NK细胞介导的抗人B淋巴瘤Raji细胞系细胞毒性的影响。一NK介导的体外细胞毒性。使用阴性选择法（Miltenyi Biotec）从正常对照者的PBMC中分离出的新鲜人类NK细胞仅用培养基（−）、单一或两种细胞因子（IL-12和IL-2）刺激，不使用培养基（–）或使用（+）lunasin（20μM）或单独使用lunasin1天。细胞因子用于IL-12和IL-2的次优浓度分别为1 ng/ml和10 U/ml。采用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验和CytoTox 96非放射性细胞毒性试验试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行体外细胞毒性试验。效应器与靶细胞以10:1的比例在37°C的5%co中共同培养4小时2培养箱。根据制造商的说明计算细胞毒性百分比。每个符号代表单个供体，以及每个供体的细胞毒性百分比(n个=5、C70、C05、C83、C37和C40）的上面板中描述了各种处理后一。每个治疗中3至4名捐赠者的平均细胞毒性百分比以平均值±SD表示一建立了一个包含6个水平治疗的混合模型来分析受试者内治疗的数据，并进行了治疗之间的配对比较，以确定P（P）值*P（P） ≤ 0.05; **P（P） ≤ 0.01.b条活化NK细胞的细胞内颗粒酶B染色。纯化NK细胞，如一单独用次优浓度的IL-2（10U/ml）或用lunasin（20μM）刺激1天，然后对颗粒酶B进行细胞内染色。从CD56明亮和CD56暗淡的NK群体中分析颗粒酶B的表达水平，并使用流式细胞术获得几何平均荧光强度（MFI）。将用IL-2+lunasin处理的明亮和暗淡群体的MFI与IL-2进行比较，颗粒酶B表达的增加百分比表示为3个对照的平均值±SD(b条).c（c）活化NK细胞介导的FasL杀伤。纯化的NK细胞如b条1天，然后用FasL阻断抗体孵育(填充钢筋)或IgG同型对照(露天酒吧)持续2小时。用体外细胞毒性试验测定活化NK细胞的FasL介导的杀伤作用一对Raji细胞的细胞毒性百分比表示为2个对照组的平均值±SD。d日人类Raji淋巴瘤异种移植模型中NK介导的细胞毒性。NOD/SCID/gc无效的2月龄（NSG）小鼠于第1天皮下注射0.5×1060.1 ml PBS中的Raji细胞与0.1 ml Matrigel混合（加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences）。从供体白细胞袋中分离出NK细胞，并用IL-2（10 U/ml）或IL-2+lunasin（lu，20 uM）处理1天。在第2天，这些经过处理的NK细胞被清洗并注射到肿瘤部位（2.5×106NK细胞/小鼠）。监测肿瘤生长，并使用标准手动卡尺测量体积。肿瘤体积（mm三)Raji对照组（无NK）中的9只小鼠，以及Raji+NK（IL-2）和Raji+KK（IL-2+lunasin）组中的7只小鼠的平均值±SD。在SAS程序中使用PROC mixed建立了一个对数据进行重复测量的混合模型，然后对不同日处理之间的平均差异进行两两比较测试*P（P） ≤ 0.05; **P（P） ≤ 0.01; 相对于Raji对照组（无NK）
图5
图5
lunasin的体内效应。一Lunasin增强血清中IFNγ的分泌。BALB/c小鼠单次腹腔注射PBS（−）、IL-2（1×10）5U/小鼠），不含（−）或含（+）lunasin（0.4 mg/kg体重），或单独使用lunasin。注射后18小时处死小鼠，并通过心脏穿刺采集血样。用ELISA法分析血清IFNγ水平。数据以每组3只小鼠的平均值±SD表示。ND，未检测到。b条,c（c）短期治疗后体内NK激活。如图所示，BALB/c小鼠连续3天每天注射一次IP。第二天处死小鼠，收集脾脏，使用流式细胞术分析NK激活。CD3−NKp46+群体上的NK细胞门控(b条)分析活化标记CD69的表面表达(c（c）,上部面板)颗粒酶B的细胞内染色(c（c）,中间面板). 在体外用GolgiPlug（Brefeldin A）孵育4h的脾细胞中分析IFNγ的产生，NK细胞群在b条用流式细胞术分析细胞内IFNγ的表达(c（c）,底部面板). 数据表示为每组5只小鼠的平均值±SD。d日–电子长期治疗后体内NK激活。如图所示，BALB/c小鼠每周连续5天每天注射一次IP，共8周。最后一次注射后三天，处死小鼠，收集脾脏以分析NK激活情况(d日)使用中描述的相同参数c（c）.采集血样，用ELISA法分析血清IFNγ(电子). 数据表示为每组5只小鼠的平均值±SD*P（P） ≤ 0.05; **P（P） ≤ 0.01; ***P（P） ≤ 0.001
图6
图6
lunasin介导的协同作用机制。一lunasin对NK细胞产生IFNγ的协同作用不需要RGD基序和多-D尾。仅用培养基（−）、不含（−。所用肽的浓度为20μM。刺激后一天，用ELISA测定上清液中IFNγ的产生。数据表示为两个不同正常对照组的平均值±SD。b条,c（c）靶基因位点的染色质重塑。仅用培养基（−）、IL-12（10 ng/ml）（不含（−。刺激1天后，对细胞进行ChIP分析。染色质DNA片段用抗乙酰-睾酮H3（AcH3）抗体免疫沉淀(b条)组蛋白H3三甲基Lys9（H3K9me3）(c（c）)以及非免疫兔血清(填充钢筋)（Millipore，Billerica，MA），个人。组蛋白修饰的相对程度IFNG公司和TGFB1型通过qPCR和ChIP qPCR引物分析对人类基因座进行比较IFNG公司（+1 kb）和TGFB1型（+1kb）（SABioscience Qiagen，巴伦西亚，CA）。为了计算ChIP结果，将免疫沉淀的DNA的量标准化为每个反应中的输入染色质，作为输入的百分比（%输入）。数据显示为3个对照组平均输入±SD的平均百分比*P（P） ≤ 0.05.d日lunasin培养NK细胞中STAT4的激活。用单个细胞因子IL-2（10 U/ml）或IL-12（1 ng/ml），或在不存在（−）和存在（+）lunasin（20μM）的情况下，以及仅在培养基和lunassin中，用这两种细胞因子刺激来自正常对照组（如图1f所示）PBMC的新鲜分离的人类NK细胞。刺激22小时后，使用培养NK细胞总蛋白提取物的Western blot检测STAT4的激活。如图所示，使用NIH ImageJ程序从密度测定的任意单位中测定磷酸化STAT4与总STAT4的比值（pSTAT4/总STAT5）。使用抗β-肌动蛋白单克隆抗体（SC-47778）（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）进行负荷控制。所示结果代表了具有相似轮廓的两个不同正常对照
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    1. Steimle V，Siegrist CA，Mottet A，Lisowska-Grospierre B，Mach B。反式激活基因CIITA介导的干扰素γ对MHC II类表达的调节。科学。1994;265（5168）：106–109。doi:10.1126/science.8016643。-内政部-公共医学
    1. Min W，Pober JS，Johnson DR。干扰素γ对TAP1和HLA I类的动力学协同诱导：干扰素伽玛对TAP1的快速诱导由Stat1α介导。免疫学杂志。1996;156(9):3174–3183.-公共医学
    1. Wang SH，Mezosi E，Wolf JM，Cao Z，Utsugi S，Gauger PG，Doherty GM，Baker JR.，JR IFNgamma通过上调Bak表达对TRAIL诱导的人甲状腺癌细胞凋亡的敏感性。致癌物。2004;23(4):928–935. doi:10.1038/sj.onc.1207213。-内政部-公共医学
    1. Fitch FW的Gajewski TF。γ干扰素在免疫调节中的抗增殖作用。I.IFN-γ抑制Th2的增殖，但不抑制Th1小鼠辅助T淋巴细胞克隆的增殖。免疫学杂志。1988;140(12):4245–4252.-公共医学

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