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非突变JAK2骨髓增生性肿瘤中的体细胞CALR突变

J南加利亚等。 N英格兰J医学. .

摘要

背景：Janus激酶2基因（JAK2）的体细胞突变发生在许多骨髓增生性肿瘤中，但带有非突变JAK2的骨髓增殖性肿瘤的分子发病机制尚不清楚，这些肿瘤的诊断仍然是一个挑战。

方法：我们对151名骨髓增生性肿瘤患者的样本进行了外显子组测序。在1345例血液肿瘤、1517例其他癌症和550例对照中评估了编码钙网蛋白（CALR）的基因的突变状态。我们利用造血集落建立了系统发育树。我们使用免疫荧光和流式细胞术评估钙网蛋白的亚细胞定位。

结果：外显子组测序在151名患者中发现1498个突变，真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维化样本中每名患者的中位数分别为6.5、6.5和13.0个突变。70-84%的JAK2非突变骨髓增生性肿瘤样本、8%的骨髓增生异常样本、偶尔的其他髓样癌样本以及其他癌症样本中均未发现体细胞CALR突变。共鉴定出148个CALR突变，其中有19个不同的变异。突变位于外显子9并产生+1碱基-对移码，这将导致具有新C末端的突变蛋白。内质网中观察到突变体钙网蛋白，但细胞表面或高尔基体堆积没有增加。与突变JAK2的患者相比，携带CALR突变的骨髓增生性肿瘤患者的血小板计数较高，血红蛋白水平较低。在造血干细胞和祖细胞中检测到CALR突变。克隆分析显示，CALR突变发生在最早的系统发育节点上，这一发现与一些患者中CALR作为起始突变的作用相一致。

结论：在大多数患有非突变JAK2的骨髓增生性肿瘤患者中发现了内质网伴侣CALR的体细胞突变。（由Kay Kendall白血病基金和其他机构资助。）。

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数字

图1
图1。151例骨髓增生性肿瘤的突变分析
A组显示了151例骨髓增生性肿瘤患者的每个样本外显子组测序中确定的突变数量和类型。这些患者包括48例真性红细胞增多症（PV）、62例原发性血小板增多症（ET）、39例骨髓纤维化（MF）和2例不可分类骨髓增生性肿瘤（MPN-U）。突变类型在每个面板的键中显示；图表下方的圆圈表示患者的突变状态：JAK2号机组,多协议标签，或否JAK2号机组或多协议标签突变。根据突变类型（B组）和骨髓增生性肿瘤亚型（C组），还显示了本研究中反复突变基因的体细胞突变数量，以及之前报告的骨髓增生性瘤中突变基因的数量。在B组中，星号表示反复突变基因的重要性（q<0.05）。Indel表示插入或删除突变。
图2
图2。CALR（校准）骨髓增生性肿瘤的突变
面板A显示了CALR（校准）骨髓增生性肿瘤（真性红细胞增多症，PV；原发性血小板增多症，ET；或骨髓纤维化，MF）中发现的突变JAK2号机组，突变多协议标签，或非突变JAK2号机组或多协议标签B组显示了两种最常见的聚合酶链反应（PCR）分析和Sanger测序的验证结果CALR（校准）骨髓增生性肿瘤患者中的变异-缺失（L367fs*46）和插入（K385fs*47）。患者的识别号高于患者粒细胞（Gran）和T细胞PCR产物的凝胶电泳结果。测序结果显示CALR（校准）左边的阴影区域突出显示了一个同源DNA序列，该序列位于CALR（校准）删除，右边的绿色箭头突出显示了五个常见碱基的反向串联复制CALR（校准）插入。面板C显示了CALR（校准）删除。数字表示每种疾病的患者数量。图D显示了CALR（校准）插入（以红色显示）。aCML表示非典型慢性粒细胞白血病、CMML慢性粒单核细胞白血病和MDS骨髓增生异常综合征。
图3
图3。具有新的C末端的改变的蛋白质阅读框架与CALR（校准）突变
图A显示了CALR蛋白的功能域，包括（从左到右）信号序列、N域（N末端）、P域（富含脯氨酸）、C域（C末端）和KDEL（内质网滞留信号）。物种间C结构域受影响部分的保护通过阴影表示，黑色表示保守区域，灰色表示部分保守区域。移码插入和删除突变的范围CALR（校准）显示了外显子9，所有这些都导致了一个常见的+1碱基-对-改变的阅读框架，并预测了一个新的缺少KDEL基序的C末端肽序列。图B显示了CALR（校准）骨髓增生性肿瘤（MPN）和常见功能丧失基因（如ASXL1型和TET2型骨髓增生性肿瘤和急性髓细胞白血病（AML）。每个基因的每种突变类型的数量都会显示出来。有关骨髓增生性肿瘤的数据来自本研究的外显子组，AML数据来自癌症基因组图谱。
图4
图4。钙网蛋白的定位和克隆异质性CALR（校准）突变
A组显示瞬时转染人胚胎肾（HEK）293T细胞的免疫印迹，分析FLAG（多肽蛋白标签）、CALR（检测内源性和转染的钙网蛋白）和β-肌动蛋白。CALR删除是L367fs*46变体，CALR插入是K385fs*47变体。CALR表达结构如免疫印迹所示。CMV-Pr表示CMV启动子。B组显示瞬时表达FLAG标记CALR变体的COS-7细胞和高尔基体报告子（半乳糖基转移酶融合到黄色荧光蛋白[GalT-YFP]）的共聚焦显微照片。红色表示FLAG；绿色，高尔基；蓝色，细胞核（4′，6-二氨基-2-苯基偶像盐酸盐[DAPI]）。图像显示，非突变和突变的CALR具有内质网定位模式，高尔基体中的积累没有增加。C组显示COS-7细胞瞬时共存的非突变（NM）CALR与绿色荧光蛋白（GFP）和FLAG标记的CALR变体的共聚焦显微照片。合并图像显示，FLAG标记的CALR变体与非突变CALR共同定位于内质网。面板D显示了来自CALR（校准）突变和非突变粒细胞-巨噬细胞集落形成单位集落来源于原发性血小板增多症患者CALR（校准）K385fs*47突变；细胞已被染上蛋白质二硫键异构酶（PDI，内质网的一种常驻蛋白）和内源性CALR。图E显示了流式细胞术分析，显示了来自健康对照组和来自突变患者的粒细胞（G）和淋巴细胞（L）中CALR细胞表面表达的程度CALR（校准）图中显示了健康对照组（三角形）和突变患者外周血中表达细胞表面CALR的活细胞百分比CALR（校准）（圆圈）。FSC表示正向散射。图F显示了5名发生突变的骨髓增生性肿瘤患者的克隆结构（以患者身份号码表示）CALR（校准）根据造血（红细胞）集落的基因分型确定。每个圆圈代表一个克隆，非突变克隆以白色显示，突变克隆以棕色显示。最早检测到的克隆显示在每个图的顶部，随后的子克隆如下所示。在每个亚克隆中获得的体细胞突变显示在相应的节点旁边，并表示除了早期亚克隆中存在的突变之外获得的那些体细胞突变。为每个节点识别的菌落数量显示在圆圈内。ET表示原发性血栓细胞增多症和ET后PET-MF骨髓纤维化。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 骨髓增生性肿瘤的另一个谜团。
    莱文RL。 莱文RL。 《新英格兰医学杂志》2013年12月19日；369(25):2451-2. doi:10.1056/NEJMe1313643。Epub 2013年12月10日。 《新英格兰医学杂志》，2013年。 PMID：24325357 没有可用的摘要。
  • 基因组学：寻找，你就会发现。。
    阿尔德顿GK。 阿尔德顿GK。 Nat Rev癌症。2014年2月；14(2):75. doi:10.1038/nrc3675。 Nat Rev癌症。2014 PMID：24457415 没有可用的摘要。
  • JAK抑制剂在CALR突变型骨髓纤维化中的作用。
    Passamonti F、Caramazza D、Maffioli M。 Passamonti F等人。 《新英格兰医学杂志》，2014年3月20日；370(12):1168-9. doi:10.1056/NEJMc1400499。 《新英格兰医学杂志》，2014年。 PMID：24645956 没有可用的摘要。

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