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.2013年11月13日；5（211）：211ra156。
doi:10.1126/scitranslmed.3006534。

胰腺β细胞未折叠蛋白反应的恢复对小鼠1型糖尿病的保护作用

费扎发动机 1, 阿列娜·耶尔马洛维奇, Truc Nguyen公司, 莎拉·亨马斯特, 傅文仙, Decio L Eizirik公司, 黛安·马西斯, 哥汗·S·霍塔米斯利吉尔
附属公司

胰腺β细胞未折叠蛋白反应的恢复对小鼠1型糖尿病的保护作用

费扎发动机等。 科学转化医学. .

勘误表in

  • 《科学与运输医学》，2013年12月4日；5（214）：第11页。Nguyen，Truc[更正为Nguyen，Truc]

摘要

内质网（ER）稳态的扰动可引起应激反应，导致糖和脂代谢异常。ER功能障碍与炎症性疾病有关，但其在自身免疫性1型糖尿病（T1D）发病机制中的作用尚不清楚。我们在两种不同的T1D小鼠模型的β细胞中发现未折叠蛋白反应（UPR）介质ATF6（激活转录因子6）和XBP1（X盒结合蛋白1）的表达缺陷，然后在T1D患者的胰腺β细胞中显示出类似的缺陷。在糖尿病前期服用化学内质网应激缓解剂牛磺脱氧胆酸（TUDCA）可显著降低T1D小鼠模型的糖尿病发病率。这种减少伴随着（i）胰腺中侵袭性淋巴细胞浸润的显著减少，（ii）β细胞存活率和形态的改善，（iii）β细胞凋亡的减少，（iv）胰岛素分泌的保持，以及（v）UPR介质的恢复表达。TUDCA的作用依赖于ATF6，并且在ATF6β细胞特异性缺失的小鼠中消失。这些数据表明，正确维护UPR对于保存β细胞至关重要，并且可以通过化学方法修复这一过程中的缺陷，以便对T1D进行预防性或治疗性干预。

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数字

图1
图1。NOD小鼠胰岛中UPR介质表达改变的时程检测
雌性NOD小鼠(n个在第3、5、7、9和13周龄时处死。(A类和B类)通过与（A）抗ATF6抗体（红色）或（B）anfrsXBPI（红色）和抗胰岛素（绿色）抗体结合，在胰腺切片上进行免疫荧光分析。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）进行复染。(C类到E类)通过MATLAB计算（C）ATF6、（D）sXBPI和（E）胰岛素的相对荧光强度（RFI）（每个时间点每只动物15至25个胰岛）。（F） NOD小鼠血清胰岛素水平(n个=14）通过酶联免疫吸附试验（EUSA）测定。所有数据均以平均值±SEM表示，通过单向方差分析（ANOVA）进行统计分析(***P（P）< 0.001; **P（P）< 0.005;*P（P）<0.05).
图2
图2。人T1D患者β细胞中UPR表达失调
(A类和B类)对非糖尿病（Ctrl）和糖尿病女性患者的胰腺切片进行分组，并与（A）抗ATF6（红色）和抗胰岛素（绿色）或（B）抗XBPI（红色）或抗胰岛素（蓝色）进行联合染色。细胞核用DAPI（蓝色）进行复染。(C类到E类)计算每个时间点15至25个胰岛的胰腺切片中（C）胰岛素、（D）sXBPI和（E）ATF6的相对荧光强度（RFI）。所有数据均以平均值±SEM表示，通过单向方差分析进行统计分析(***P（P）< 0.001; **P（P）< 0.005; *P（P）< 0.05).
图3
图3。TUDCA治疗后NOD和RIP-LCMV-GP小鼠糖尿病发病率降低
（A）雌性NOD小鼠(n个在10周龄时开始每天两次腹腔注射TUDCA（250 mg/kg）或载体（PBS），并监测30周龄前的血糖水平。(B类)对RIP-LCMV-GP小鼠进行同样的治疗(n个=12）LCMV诱导糖尿病后立即[2×10三斑块形成单位（PFU）/ml]和血糖水平监测2周。(C类)治疗2周后，测定了不同剂量TUDCA对RIP-LCMV-GP动物糖尿病发病率的降低。(D类)采用ELISA法测定无糖尿病（Veh-ND）、糖尿病（Veh-D）和TUDCA治疗的NOD小鼠（TUDCA）的血清胰岛素水平。(E类)使用H&E对载剂（PBS）或TUDCA治疗的NOD小鼠（30周龄）的胰腺切片进行染色。上部面板显示了载剂治疗的无糖尿病小鼠（Veh-ND）的代表性图像。与经车辆治疗的糖尿病（Veh-D）NOD小鼠（中面板）相比，TUDCA治疗（下面板）能更好地保存胰岛形态，减少淋巴细胞浸润。用抗胰岛素和抗胰高血糖素抗体对这些胰岛进行免疫荧光分析，表明TUDCA治疗的小鼠中存在功能性β和α细胞。(F类)用H&E染色（左面板）或用胰岛素和胰高血糖素免疫荧光分析（右面板）检查车用治疗（PBS）（上面板）或TUDCA治疗（下面板）RIP-LCMV-GP小鼠的胰腺切片。数据以平均值±SEM表示，通过Kaplan-Meier估计（A）、χ进行统计分析2测试（B）或单向方差分析（D）(***P（P）< “ 0.001; *P（P）< 0.05).
图4
图4。缺乏TUDCA诱导的NOD胰腺免疫细胞群的改变
用TUDCA（每天500mg/kg）或载体（PBS）治疗10周龄雌性NOD小鼠(n个=每组7人），持续4周。分离并分散每个胰腺，用CD45、CD4、CD8、CD19、CD25和Foxp3抗体染色后用流式细胞仪分析细胞。细胞预处理为CD45+. (A类)CD4的分数+或CD8+代表性点图中的T细胞。(B类和C类)所有小鼠的汇总数据。(D类和E类)Foxp3的对应点图和汇总数据+预处理为CD45的细胞+和CD4+. (F类和G公司)预处理为CD45+的CD19+B细胞的相应点图和汇总数据。Student的t检验没有显示载体和TUDCA处理的细胞之间有任何显著的统计学差异。
图5
图5。TUDCA处理的NOD和RIP-LCMV-GP小鼠胰岛中适应性UPR介质的恢复
(A类)胰腺切片（f）从30周龄的车用非糖尿病（Veh-ND）(n个=5），车辆治疗糖尿病（Veh-D）(n个=4），TUDCA处理(n个=9）用抗ATF6（红色）和抗胰岛素（绿色）染色的NOD小鼠。细胞核用DAPI（蓝色）复染。(B类)车辆治疗非糖尿病（Veh-ND）、车辆治疗糖尿病（Veh-D）和TUDCA治疗NOD小鼠胰岛中胰岛素和ATF6的相对荧光强度（RFI）的定量。(C类)16周龄的车用糖尿病小鼠（上面板）或TUDCA治疗的RIP-LCMV-GP小鼠（下面板）的胰腺切片被ATF6抗体（红色）和胰岛素抗体（绿色）染色。细胞核用DAPI（蓝色）进行复染。(D类)载体和TUDCA治疗小鼠中胰岛素和ATF6的胰岛荧光强度定量。(E类)对用PBS载体（n=8）或TUDCA治疗的10周龄NOD小鼠胰腺H&E染色台阶切片进行胰岛评分(n个=8）持续4周。(F类)对经溶媒或TUDCA治疗的NOD小鼠胰岛进行量化，以确定是否存在未显示胰岛炎的胰岛(*P（P）< 0.05). (G公司)对经溶媒或TUDCA治疗的NOD小鼠胰岛进行量化，以确定是否存在显示侵袭性胰岛炎的胰岛。TUDCA治疗的小鼠具有侵袭性胰岛炎的胰岛百分比显著降低。(H（H）)用TUNEL法评估对照组和TUDCA治疗组动物的胰腺细胞凋亡。(我和K（K）)溶媒和TUDCA治疗的正常血糖NOD小鼠胰腺与（I）抗ATF6（红色）或（K）抗XBPI（红色）和抗胰岛素（绿色）抗体共染。根据胰岛炎评分[在（E）中确定]对车用治疗动物进行分组，胰岛炎得分最低的组显示在上面板中。患有严重胰岛炎的车辆治疗动物显示为Veh*（中间面板）。TUDCA处理的动物的染色如下图所示。相对荧光强度分析显示显著降低(J型)ATF6和(L（左）)sXBPI在胰岛素评分较高的组中表达，而TUDCA治疗组的动物与胰岛素评分较低的动物表现出相似的表达程度。所有组（J和L）的胰岛中胰岛素表达相同。数据以平均值±SEM表示，通过单向方差分析（B、J和L）或Student’st吨测试（D和F至H）(***P（P）< 0.001; *P（P）< 0.05).
图6
图6。TUDCA驱动的β细胞对细胞因子和内质网应激诱导的细胞死亡的保护作用
(A类)用TUNEL法评估载体或TUDCA治疗的RIP-LCMV-GP小鼠胰腺切片的凋亡。白色箭头表示TUNEL阳性细胞。(B类)用衣霉素（1µg/ml）处理Min6细胞18小时，加入或不加入TUDCA，并用TUNEL法测定细胞死亡。(C类)Min6细胞按in（B）处理，用抗p-JNK、抗CHOP、抗裂解PARP和抗caspase-3抗体进行Western blotting分析凋亡标志物。(D类)用1µM thapsigargin和250µM TUDCA处理Min6细胞24小时。用XTT{钠3′-[（1-苯基氨基羰基）-3,4-四氮唑]-双（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸水合物}测定法评估细胞活力。(E类)用含有或不含250µM TUDCA的细胞因子混合物处理Min6细胞40小时。用XTT法评估细胞活力。(F类)用表达3XFIag标记ATF6的慢病毒转导的Min6细胞。用3µM多西环素处理Min6细胞24小时后，向培养基中添加1µM thapsigargin 24小时，并用XTT公司化验。(G公司)用3µM多西环素处理转导的Min6细胞24小时，将细胞因子混合物添加到培养基中24小时，并用XTT法测定细胞活力。(H（H）)用3µM多西环素处理转导的Min6细胞24小时，向培养基中添加1µM thapsigargin，并继续培养24小时。细胞凋亡标志物用抗CHOP和抗caspase-3抗体进行Western blotting分析。(我)用载体或0.1µM多西环素处理转导的Min6细胞24小时。将Thapsigargin（1µM）添加到培养基中，在存在或不存在30µM TUDCA的情况下再继续培养24小时，然后使用XTT分析测定细胞活力。(J型)用表达3XFIag标记ATF6的慢病毒转导培养的Min6细胞，然后用载体或3µM多西环素处理24小时。然后将Thapsigargin（1µM）添加到培养基中，在有或无50µM TUDCA的情况下再继续培养24小时，并通过胰岛素ELISA测定低血糖和高糖条件下的GSIS。在三个独立实验中重复了结果。数据以平均数±SEM表示，通过Student的f检验（A、B和D到G）或单向方差分析（I和J）进行统计分析(***P（P）< 0.001;*P（P）<0.05).
图7
图7。TUDCA通过UPR的ATF6分支保护β细胞
（A）用于产生条件β细胞特异性ATF6缺陷（ATF6）的靶向载体的示意图β−/−)老鼠。(B类)对照组和ATF6的基因分型β−/−用尾部DNA对小鼠进行检测。(C类)进行免疫荧光测定以验证组织特异性缺失ATF6型. (D类)将载体（PBS）或TUDCA（250 mg/kg，每日两次，通过腹腔注射）应用于ATF6野生型（wt）对照小鼠或ATF6β−/−LCMV（2×10）诱导糖尿病后RIP-LCMV-GP小鼠三PFU/ml）和血糖水平监测2周。(E类)女性对照和ATF6β−/−; RIP-LCMV-GP；lns2Cre小鼠用载体或TUDCA治疗(n个=每组4人），持续2周。(F类)然后处死小鼠，用MATLAB量化胰岛素（绿色）或sXBPI（红色）表达的相对免疫荧光强度（RFI）（每组每只动物20至30个胰岛）。(G公司)来自载体或TUDCA治疗对照组和ATF6的胰腺切片β−/−RIP-LCMV-GP小鼠(n个每组＝4个，每组20至30个胰岛）用TUNEL测定法检测细胞凋亡。所有数据均以平均值±SEM表示，通过单向方差分析进行统计分析(***P（P）< 0.001; **P（P）< 0.005; *P（P）< 0.05).
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