跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2014年1月；25(1):145-59.
doi:10.1091/mbc。E13-09-0525。 Epub 2013年11月6日。

Fis1基因突变破坏了缺陷线粒体的有序处置

沈勤芳 1, 山野Koji Yamano, Brian P负责人, 川井住友, 杰斯明·T·M·张, 王春欣, 郑洪秋（Jeong-Hoon Cho）, Nobutaka Hattori公司, 理查德·尤尔, 亚历山大·范德布利克
附属公司

Fis1基因突变破坏了缺陷线粒体的有序处置

沈勤芳等。 分子生物学细胞. 2014年1月.

摘要

后生动物中的动力相关蛋白Drp1介导线粒体分裂。Drp1被线粒体外膜蛋白Mff从细胞液招募到线粒体。另一种线粒体外膜蛋白，命名为Fis1，先前被提议作为补充因子，但Fis1（-/-）细胞有轻微或无线粒体分裂缺陷。在这里，我们表明Fis1是后生动物细胞线粒体裂变复合体的一部分。在裂变周期中，Drp1首先与线粒体表面的Mff结合，然后进入包含Fis1和ER线粒体界面内质网（ER）蛋白的复合体。Fis1的突变通常不会影响裂变，但当特定的线粒体毒素被用于诱导裂变时，它们可以破坏下游的降解事件。Fis1突变引起的破坏导致大的LC3聚集体的积累。我们得出结论，Fis1可以在ER线粒体界面与Mff顺序作用，将应激诱导的线粒体分裂与下游降解过程耦合。

PubMed免责声明

数字

图1：
图1：
Mff和Fis1对小鼠线粒体分裂的影响秀丽线虫（A）线粒体秀丽线虫如图所示，在菌株中用线粒体外膜标记物（YFP:：Tom70，绿色）标记体壁肌肉。右，Mff、Fis1-Mff和Drp1突变图像的放大图。（B） 肌肉特异性FIS-1和YFP:：FIS-1过度表达的影响肌-3发起人。线粒体用YFP:：TOM70标记。作为外膜蛋白对线粒体形态影响的对照，我们使用了喂养RNAi和另一种线粒体外膜蛋白（外周苯二氮卓类受体[PBR]）的过表达构建体。棒材，10μm。
图2：
图2：
Fis1基因触发大的自噬聚集物的形成。（A） CFP:：LGG-1（蠕虫LC3，红色）与YFP:：TOM70（绿色）一起在蠕虫肌肉细胞中外显表达。虫子未经处理或用百草枯或抗霉素A孵育。百草枯和抗霉素处理的虫子可以在不使用药物的情况下在平板上恢复（分别为5和4小时）。棒材，10μm。（B） 骨料尺寸，以单元表面积的百分比表示。方框图表示每个条件40个或更多单元格(第页用未配对学生的t吨测试）。（C） 用百草枯处理的Fis1突变体中LGG-1聚集体（红色）和线粒体（绿色）的表面呈现与a中相同，但没有恢复时间。两个例子。这些渲染是由共焦显微镜图像（由27幅图像叠加而成，步长为230 nm）生成的。左下角，红色通道的不透明度设置为50%，以可视化嵌入的线粒体（标记为合并50%）。否则，不透明度设置为100%。棒材，1μm。
图3：
图3：
Mff和Drp1突变抑制聚集形成。（A） Fis1双突变体在26°C下生长时具有较大的聚集体。在这些条件下，Fis1-Mff四倍突变体具有更小的聚集体。标记如图2A所示。棒材，10μm。（B） 骨料尺寸，以单元表面积的百分比表示。方框图表示每个条件40个或更多单元格(第页用未配对学生的t吨测试）。显示了25和26°C下的生长结果。（C） Mff或Drp1突变抑制了百草枯和抗霉素A诱导的Fis1双突变体中的聚集形成。结果的量化如B所示。
图4：
图4：
Pink1中的突变减少了新生的线粒体数量，并抑制了Fis1突变体中的聚集形成。（A） 百草枯处理1h后诱导有丝分裂。通过CFP:：LGG-1（红色）和YFP:：TOM70（绿色）在线粒体表面的斑点（箭头）共定位检测到新生的线粒体吞噬体。只要这些斑点较小（直径≤1μm），就被归类为吞噬线粒体。较大的斑点被归类为聚集物。菌株是fis-1（tm1861）；fis-2（gk414）,粉红色-1（tm1799）、和pink-1（tm1799）fis-1（tm1861）；fis-2（gk414）（分别标记为Fis1、Pink1和Fis1-Pink1）。棒材，5μm。（B） 显示不同菌株中每个细胞CFP和YFP共定位点发生情况的箱线图（每个条件≥100个细胞，未配对学生t吨测试）。（C） 百草枯、抗霉素A和温度诱导Fis1、Pink1和Fis1-Pink1突变菌株中的聚集物形成。骨料尺寸显示为细胞表面积的百分比。方框图表示每个条件下≥40个细胞(第页用未配对学生的t吨测试）。（D）秀丽线虫肌肉细胞标记有（顶部）Parkin（PDR:：CFP，红色）和YFP:：TOM70（绿色）或（底部）Parkin。用百草枯（PQ）处理的左、野生型和右Fis1突变体。棒材，10μm。
图5：
图5：
哺乳动物Fis1的特征负极/负极和Mff负极/负极细胞。（A） Western blot显示HCT116 Fis1中没有Fis1负极/负极细胞和Mff不存在于HCT116 Mff中负极/负极细胞。Drp1和Mfn1表达水平没有改变。将少量和大量细胞裂解物加载到凝胶上进行比较。（B） 野生型Mff抗Tom20抗体免疫染色检测线粒体形态负极/负极和图1负极/负极细胞。（C） HCT116野生型Fis1线粒体形态的定量负极/负极和Mff负极/负极未经处理或用抗霉素A或CCCP处理10分钟的细胞。这些细胞用MitoTracker Green染色并拍照。对每种情况下的30张图像进行编码，并与其他情况下的图像合并，从而实现盲分类。细胞被分类为以碎片状、短管状或长管状线粒体为主。三个独立实验的平均值和标准差。第页值是由一个未配对的学生的t吨测试。
图6：
图6：
Fis1中形成了大型LC3骨料负极/负极哺乳动物细胞。（A） HCT116 Fis1中抗霉素A诱导的LC3聚集体负极/负极细胞，但不是野生型（WT）或Mff负极/负极细胞。HCT116重量，Fis1负极/负极和Mff负极/负极用GFP-LC3和mCherry-Parkin表达载体转染细胞，18h后用抗霉素A孵育3h，诱导Parkin转位到线粒体上，并用抗Tom20抗体免疫染色标记线粒体。Bar，10μm。（B） GFP-LC3聚集体的形成通过转染显性阴性的Drp1突变体（Drp1K38A公司). A中的转染和药物（C）通过将LC3分布分类为弥散细胞溶质、弥散点状或大聚集体，对A和B进行量化。未经处理的细胞（无抗霉素A）没有聚集物（未公布的数据）。三个独立实验的平均值和标准偏差（>100个细胞/实验）。（D） HCT116 WT细胞和Fis1中免疫金标记的GFP-LC3负极/负极单元格。棒材，1μm。
图7：
图7：
Fis1在与哺乳动物细胞中的溶酶体融合之前发挥作用。（A） 用荧光检测线粒体的清除。用扰乱的或Fis1 siRNA寡核苷酸转染稳定表达GFP Parkin的HeLa细胞，然后用抗霉素A处理指定的时间。将细胞固定并用Tom20抗体染色（荧光图像中显示了0和48小时处理；条形，10μm）。在直方图所示的时间点，评估100个或更多细胞是否存在线粒体和Parkin的扩散，作为独立标准。（B） Western blots检测线粒体清除。用siRNA转染表达GFP-Parkin的HeLa细胞，并用溶剂（二甲基亚砜）、抗霉素A或抗霉素A+巴非霉素A1培养48小时。用线粒体基质蛋白（ClpP）、细胞溶质蛋白（微管蛋白）和三种线粒体外膜蛋白（Tom20、Tom40和Fis1）的抗体检测蛋白质印迹。结果表明，在打乱和Fis1 siRNA细胞中，线粒体外膜和基质蛋白降解程度相似。（C） Western blot显示在Fis1中脂质LC3的积累和p62降解的抑制负极/负极抗霉素A HCT116 WT和Fis1处理的细胞负极/负极在细胞裂解和免疫印迹之前，用抗霉素A处理稳定表达EYFP-Parkin的细胞株3或6小时。（D） 缬氨霉素诱导Fis1中LC3脂质化增加负极/负极细胞，类似于抗霉素A治疗，但这种增加并不反映自噬的总体增加，如巴非霉素A1进一步降解受阻所示，也不反映线粒体降解受阻，如缬霉素引起的Fis1中Mfn1的持续降解所示负极/负极细胞。HCT116 WT和Fis1负极/负极将YFP-Parkin表达稳定增强的细胞系与缬霉素或不与之孵育1h，然后与bafilomycin A1或不与其孵育5h。星号表示非特定带。（E） 大自噬不会导致Fis1中LC3脂质过多负极/负极与WT细胞相比。在表达HCT116 WT和Fis1的EYFP-Parkin中诱导大自噬负极/负极细胞通过6小时氨基酸饥饿或与磷酸钙沉淀（CPP）孵育4小时。（F） 饥饿诱导的大自噬细胞中缺乏LC3聚集。GFP-LC3–转染HCT116 WT和Fis1负极/负极细胞遭受6h氨基酸饥饿，并用荧光显微镜进行分析。棒材，10μm。
图8：
图8：
当裂变被诱导时，Drp1与Fis1进入复合物。（A） 用HA-Drp1转染HeLa细胞，并用CCCP处理指定时间以诱导线粒体分裂。然后用DSP处理细胞并用1%十二烷基硫酸钠溶解，然后用模拟（Ctrl）或小鼠HA抗体进行共免疫沉淀。用兔抗HA、Mff和Fis1抗体检测Western blot。（B） Top，用HA-Drp1（S600A）或HA-Drpl（S600D）转染HeLa细胞，用DSP处理，用HA抗体共免疫沉淀，以及检测内源性Fis1的结果。Calnexin也与HA-Drp1共免疫沉淀（S600D），但不与HA-Drp1共免疫沉淀（S600A）。下图，与FLAG标记的Fis1共转染并与FLAG抗体共免疫沉淀后获得的结果。（C） 线粒体形态秀丽线虫线粒体外膜标记检测肌肉细胞(P（P）肌-3：：Tom70:：YFP). 线粒体drp-1（tm1108）蠕虫是高度连接的。用转基因DRP-1（wt）、转基因DRP-1-S590A或转基因DRP-1-（S590D）恢复线粒体分裂。棒材，10μm。（D） 肌肉细胞中LGG-1的聚集大小drp-1（tm1108）如图所示，用化学物质处理过的蠕虫。用转基因DRP-1（wt）、转基因DRP-1-S590A或转基因DRP-1-（S590D）恢复线粒体分裂。骨料尺寸如图2B所示，以单元表面积的百分比表示(n个>40个细胞/条件，未配对学生t吨测试）。
图9：
图9：
Drp1-Fis1复合物也包含ER蛋白。（A） 用HA-Drp1转染HeLa细胞并如图8A所示进行处理，但不是用CCCP，而是用抗霉素A（Ant）、佛波豆蔻酸（PMA）或葡萄孢菌素（STS）培养3小时，然后用RIPA交联和裂解。用HA、Fis1、calnexin、Bap31、Tom40、porin和Tom20抗体检测斑点。当细胞用staurosporine（岩川）处理时，Bap31被caspase 8依赖性裂解部分降解等。，2011），但这种治疗也明显诱导了与Drp1的共免疫沉淀。（B） 用打乱或Fis1 siRNA寡核苷酸转染HeLa细胞，然后在2天后用HA-Drp1转染，然后像在A中一样处理。（C） 用mls:：mCherry（红色）、ER标记ss:YFP:：KDEL（绿色）和CFP:：LGG-1（蓝色）进行三重标记。图像显示LGG-1团簇含有ER.Bar，10μm。（D） 用RNAi生长的野生型蠕虫和Fis1突变体肌肉细胞的聚集大小秀丽线虫PACS-2（T18H9.7）或Bap31（Y54G2A.18）同源物，然后用百草枯治疗。骨料尺寸显示为细胞表面积的百分比。箱线图表示≥40个单元格/条件(第页用未配对学生的t吨测试）。（E） 图中显示了Drp1、Mff和Fis1在线粒体分裂和随后通过有丝分裂降解过程中的作用位置。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Alirol E、James D、Huber D、Marchetto A、Vergani L、Martinou JC、Scorrano L。线粒体裂变蛋白hFis1需要内质网通道来诱导凋亡。分子生物学细胞。2006年；17:4593–4605.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bleazard W、McCaffery JM、King EJ、Bale S、Mozdy A、Tieu Q、Nunnari J、Shaw JM。动力学相关GTPase Dnm1调节酵母中的线粒体分裂。自然细胞生物学。1999;1:298–304.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Breckenridge DG、Kang BH、Kokel D、Mitani S、Staehelin LA、Xue D。秀丽隐杆线虫drp-1和fis-2在ced-3下游调节不同的细胞死亡执行途径，并且独立于ced-9。分子细胞。2008;31:586–597.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chan NC、Salazar AM、Pham AH、Sweredoski MJ、Kolawa NJ、Graham RL、Hess S、Chan DC。Parkin广泛激活泛素蛋白酶体系统对有丝分裂至关重要。人类分子遗传学。2011;20:1726–1737.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Deng H，Dodson MW，Huang H，Guo M.帕金森氏病基因pink1和parkin促进果蝇线粒体分裂和/或抑制融合。美国国家科学院院刊2008；105:14503–14508.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型