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.2014年1月；42(2):999-1015.
doi:10.1093/nar/gkt921。 Epub 2013年10月24日。

REST介导雄激素受体对基因抑制的作用并预测前列腺癌的早期复发

夏洛特·斯文森 1, 延斯·塞德, 迭戈·伊格莱西亚斯·加托, 银川, 见童鹏, 安德斯·比亚特尔, 罗克萨娜·梅里诺·马丁内斯, 劳拉·博特, 莱泽克·赫尔钦斯基, 大卫·乌尔默特, 王宇酌博士, 牛元杰, 科林·柯林斯, 阿米尔卡·弗洛雷斯·莫拉莱斯
附属公司

REST介导雄激素受体对基因抑制的作用并预测前列腺癌的早期复发

夏洛特·斯文森等。 核酸研究. 2014年1月.

摘要

雄激素受体（AR）是前列腺肿瘤发生的关键调节因子，其作用尚不完全清楚。我们确定阻遏物元件（RE）-1沉默转录因子（REST）是AR对基因抑制作用的介体。染色质免疫沉淀显示，AR结合染色质区域，该区域包含特征良好的顺式元素，已知这些顺式元素可介导REST转录抑制，而细胞成像研究证实，REST和AR在体内密切共存。雄激素诱导的基因阻遏还涉及通过对泛素连接酶β-TRCP的作用调节REST蛋白的转换。雄激素缺乏或雄激素受体阻断抑制剂MDV3100（Enzalutamide）导致神经内分泌（NE）分化，这是REST失活所模拟的现象。基因表达谱分析显示，REST不仅抑制神经元基因，还抑制参与细胞周期进程的基因，包括Aurora激酶A，该酶以前曾与NE样去势抵抗肿瘤的生长有关。前列腺癌组织微阵列分析显示，REST表达降低的肿瘤早期复发的概率更高，与Gleason评分无关。REST调节前列腺上皮的AR作用，并且REST表达与前列腺切除术后疾病复发呈负相关，这一证明需要更深入地描述其在前列腺癌发生中的作用。

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数字

图1。
图1。
通过ChIP分析AROR。(A类)定量PCR分析经DHT治疗或不经DHT处理2小时的LNCaP细胞中ARE和RE-1基因启动子区AR结合。所有基因名称由genenames.org提供。学生t吨-试验用于分析DHT处理样品与对照样品之间观察到的差异的统计显著性(*P（P）<0.05和**P（P）< 0.01). (B类)热图显示了在ChIP分析中启动子结合AR的基因在雄激素或比卡鲁胺治疗下的表达变化。数据来自GEO数据库(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). 显示了实验登录号(C类)ChIP微阵列分析。在ChIP微阵列分析中，AROR（深灰色）中包含指示转录因子结合位点的区域数量，或一组未结合AR的对照区域数量，表示为对照（浅灰色）。只有TFBS具有统计显著性(P（P）<0.05，χ2分析）显示AROR内的过度表达。转录因子结合位点使用JASPAR相似性矩阵名称命名如下：REST，阻遏因子-1沉默转录因子；过氧化物酶体增殖激活受体γ；雄激素受体；核因子κB，B细胞中κ轻多肽基因增强子的核因子；维生素D受体；ESR1，雌激素受体1；组蛋白H4转录因子；bZIP911、ELK4、ETS结构域蛋白；E2F1、E2F转录因子；Su（H），无毛的抑制物；NR2F1，核受体亚家族2，F组，成员1；MAX MYC，MYC相关因子X；Ras应答元件结合蛋白1；T、 T盒蛋白；TEAD1，转录增强因子TEF1；和NR2F1，核受体亚家族2，F组，家族1。(D类)对经DHT处理或不经DHT治疗2 h的LNCaP细胞中ARE和RE-1基因启动子区REST结合的ChIP分析t吨-测试(*P（P）< 0.01).
图2。
图2。
前列腺癌细胞中REST和AR的共放大。(A类)REST和AR的蛋白表达水平通过与特定抗体共同染色来测量，并通过共焦显微镜的免疫荧光来观察。对REST（594 nm）和AR（488 nm）的平行图像进行分析。显示了在DHT中生长的细胞中REST和AR表达的典型图像。用DAPI进行核染色。图像显示了REST和AR的核和细胞溶质共同定位(B类)相关系数是根据在波长和细胞核内获得的像素信号强度测量值计算得出的。该参数表示为AR/REST共同定位系数。星号表示DHT处理细胞和对照细胞之间存在统计显著差异(P（P）<0.001，学生t吨-测试）。
图3。
图3。
现场邻近连接分析。(A类)REST/AR联合本地化的代表性图像就地通过邻近连接测定法可视化。用所示的REST和/或AR抗体对LNCaP细胞进行染色，并进行邻近结扎分析以测量其共定位就地通过在634nm波长处出现高强度荧光斑点可见。使用识别AR的两种不同抗体和从不同物种中获得的抗体作为阳性对照。在没有一种主要抗体的情况下进行的分析被用作阴性对照。(B类)AR和REST的共同定位是通过量化单个细胞细胞核中的荧光点数量（α，P（P）< 0.0001).
图4。
图4。
雄激素调节REST功能。(A类)用类固醇饥饿LNCaP细胞，然后用DHT处理24小时。RT-PCR用于测量四个已知REST靶基因的表达水平：BDNF、Grin2a、NTRK3和Synapsin1。所有差异均具有统计学意义(*P（P）< 0.01). (B类)在脉冲追逐实验中，LNCaP细胞用35S-蛋氨酸，用雄激素治疗2和4小时，然后免疫沉淀REST，并通过放射自显影术进行分析。(C类)用两个靶向REST或AR的siRNA转染LNCaP细胞，然后测量所示基因的mRNA水平。星号表示转染对照siRNA的细胞与靶向AR或REST的细胞之间存在统计显著差异(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01). Western blot显示REST和AR基因敲除后的REST和ER蛋白水平。(D类)一种由含有REST响应元件（RE-1）的突触蛋白酶1基因启动子区驱动的萤光素酶报告子构建体并且使用一种缺失RE元件N末端半区的变体来评估转染了靶向REST和AR的siRNAs的细胞在有无雄激素的情况下对REST介导的抑制。siControl和Syn-Luc转染的细胞与其他实验组的荧光素酶活性的比较存在显著差异，如下所示*P（P）<0.05或**P（P）< 0.01. 对照组转染的Syn-luciferase突变体与其余组之间的显著差异用α标记，P（P）< 0.01. (E类)测量含有RE-1的BDNF、Syn1和Grin2a基因启动子内的REST和AR与染色质区域的结合，或与PSA基因增强子中的ARE的结合。还测量了DHT处理对REST和AR染色质结合的影响。用q-PCR进行DNA量化。通过Student’st吨-测试(*P（P）<0.01和**P（P）< 0.05). 还分析了DHT处理和未处理样品之间的统计差异（α表示P（P）< 0.05) (F类)使用指定的治疗方法测量LNCaP细胞中的REST、AR和β-TRCP水平。
图5。
图5。
REST调节LNCaP细胞的NE分化。(A类)在DHT存在和不存在的情况下，雄激素耗竭细胞中NE标记物嗜铬粒蛋白A和REST的蛋白水平。(B类)REST靶基因的mRNA水平：Grin2a、NTRK3和NE标记嗜铬粒蛋白A，实验同上。(C类)通过分析雄激素剥夺7天期间或在雄激素（+DHT）存在下生长但转染了靶向REST或AR的siRNAs的细胞中细胞质延伸过程的长度来量化NE分化。使用Wilcox等级检验进行统计分析；星号表示具有统计学意义的差异(P（P）<0.001），而α表示显著差异(P（P）<0.001）与对照非转染细胞−DHT相比。(D类)REST和AR基因敲除中CgA的mRNA水平(*P（P）<0.05，学生的t吨-测试）。(E类)AR拮抗剂MDV3100治疗72小时和96小时后嗜铬粒蛋白A的蛋白质和mRNA水平。(F类)在去势或完整小鼠中生长的LNCaP或感光性异种移植物中的嗜铬粒蛋白A和REST水平。
图6。
图6。
REST敲除对基因表达的影响。(A类)基因表达谱用于识别增加REST下调表达的蛋白编码基因。根据基因本体论分类，被赋予生物功能的受调控基因。与对整个基因组和相关基因组进行的类似分析相比，特定类别的丰富性P（P）进行了计算。结果(P（P）<0.05）。节点识别功能类别，大小表示基因数量，颜色表示P（P）-值。边缘的厚度表示类别之间重叠基因的数量。(B类)在特定类别中确定的选定基因。REST 1、2和3代表用三个独立的REST靶向siRNA进行的实验。对数转换的折叠比由色码表示。(C类)REST敲除持续上调所选基因的表达变化，而合成雄激素R1881（10 nM）也会抑制这些基因的表达DHT表明雄激素缺乏引起的变化。(D类)如上所述，通过显示由REST敲除持续上调的选定基因，REST敲低也是由合成雄激素R1881（10 nM）治疗诱导的。
图7。
图7。
PCa-TMA连续切片中REST和AR表达的免疫组织化学分析。(A类)良性腺体和肿瘤的组织核心示例（Gleason 7级和5级）说明了REST和AR表达的相关性(B类)对于REST蛋白水平低（1，n=13）、中（2，n=22）或高（3，n=49）的患者，或根据前列腺切除时的Gleason分级，前列腺癌根治术后PSA复发时间的Kaplan-Meier曲线：G<7，n=51；G=7，n=35；G>7，n=8（右侧面板）。这个P（P）-根据Mantel–Cox测试计算值。表1总结了与临床参数相关的REST免疫反应性。
图8。
图8。
PCa细胞中AR和REST功能交互的工作模型。(A类)雄激素可以通过抑制β-TRCP（一种已知的REST泛素连接酶）的表达来减少REST的转换。在雄激素存在的情况下，REST积累并转移到细胞核，在那里它可以结合AR（AROR）占据区域的染色质。根据序列上下文，这种结合导致不同的转录结果：(B类)基因启动子中REST与RE-1位点的持续结合导致转录抑制。(C类)REST与ARE区域的结合在某些情况下可以限制雄激素对转录的刺激作用。(D类)许多区域可以结合AR和REST，对附近基因的转录没有明显影响。这些结合事件的结果可能由尚未确定的辅助蛋白和染色质修饰剂决定。
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