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。2013年10月14日；24(4):450-65.
doi:10.1016/j.ccr.2013.08.020。 Epub 2013年10月3日。

谷氨酰胺敏感性分析确定xCT逆向转运蛋白是常见的三阴性乳腺肿瘤治疗靶点

路易卡·A·蒂默曼 1, 托马斯-霍尔顿, 玛丽亚·尤尼娃, 雷蒙德·J·路易, 梅塞·帕多罗, Anneleen Daemen公司, 胡敏（音）, 丹尼斯·A·陈, 斯蒂芬·P·埃塞尔, 劳拉·范特·维尔, 科内利亚·波利亚克, 弗兰克·麦考密克, 乔·W·格雷
附属公司

谷氨酰胺敏感性分析确定xCT反向转运蛋白是常见的三阴性乳腺肿瘤治疗靶点

路易卡·A·蒂默曼等人。 癌细胞。 。

摘要

少数肿瘤衍生细胞系构成了癌症治疗发展的支柱，产生的药物的影响通常以疾病进展的几个月来衡量。为了开发更有效的乳腺癌治疗药物并更容易了解其临床影响，我们构建了46个独立衍生乳腺细胞系的功能代谢图谱。我们对谷氨酰胺摄取和依赖性的分析确定了谷氨酰胺营养不良的三阴性样本子集。环境谷氨酰胺通过xCT反转运蛋白间接支持环境胱氨酸的获取，该转运体在体内三分之一阴性肿瘤上表达。临床批准的抗炎药柳氮磺胺吡啶的xCT抑制作用可降低肿瘤生长，揭示了预后最差的乳腺肿瘤的治疗靶点，以及快速有效药物开发的先导化合物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

我们声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。乳腺源性细胞系的营养消耗
图形键中的图标代码；虚线将增殖的非肿瘤样本值括起来。图标表示平均值+/-SD。（A）比较我们研究中用于描述样本的两个术语。所示每种类型的样本数量。（B） 与未标记培养物相比，使用2-NBDG或6-NBDG标记葡萄糖培养4小时后细胞系的荧光增强。（C） 根据标准增长曲线计算的人口倍增时间。（D） 4小时时的葡萄糖摄取量（来自B部分）与谷氨酰胺消耗量（来自培养24小时时的培养基消耗量，根据细胞数量进行标准化）。（E） 与HMECd样品相比，4个克劳丁低样品的氨基酸消耗量消耗少量葡萄糖或谷氨酰胺。D中得出的值；钥匙中的标准三字母氨基酸代码。（F） 24小时谷氨酰胺消耗量与。hGAC公司基因芯片杂交信号。y轴上的绿色方块是平均值hGAC公司来自3 CD10的信号+和3 BerEP4+纯化正常乳房样本。（G） 差速器hGAC公司基底与管腔或内质网的表达+与ER相比−8个临床乳腺肿瘤数据集的样本，下载自NCBI GEO和Chin 2006（Chin等人，2006）。配对箱形图下的t检验p值。另请参见图S1和表S1、S2、S3。
图2
图2。谷氨酰胺限制减缓培养扩大
图形键中的图标代码；虚线将非肿瘤样本值括起来；C、 全媒体；Q-，无谷氨酰胺培养基；无葡萄糖培养基。图标表示在无谷氨酰胺培养基中生长的每个细胞系的第5天培养大小的平均值+/-SD。（B） 在具有两倍于正常葡萄糖浓度（2X GU，y轴）的无谷氨酰胺培养基中的第5天培养尺寸与具有正常葡萄糖水平（x轴）的无谷氨酰胺培养基相比，每个培养尺寸均标准化为在对照培养基中的培养。（C-F）非肿瘤性样本184A1和类似敏感性肿瘤线H3153中的谷氨酰胺剥夺反应（箭头，面板a）。（C） 细胞滴定发光/ATP含量分析得出的生长曲线。x轴以下的数字，手动计数（台盼蓝）得出的细胞数与ATP值之比。（D） AMPK激活磷酸化、PARP裂解和ACC抑制磷酸化的比较。（E） 在指定条件下培养第5天时的细胞周期分布、有丝分裂图计数、S期分数和培养物大小。CF，在完全培养基中汇合细胞。（F） 第5天无谷氨酰胺培养基中高密度培养物与低密度培养物的培养大小差异。（G） 谷氨酰胺消耗量（来自图1D）与来自A部分（H）的无谷氨酰胺培养物大小hGAC公司基因芯片杂交信号与来自A部分的无谷氨酰胺培养物大小的比较。y轴上的绿色方块是平均值hGAC公司来自3 CD10的杂交信号+和3 BerEP4+纯化正常乳房样本。另请参见图S2。
图3
图3。谷氨酰胺限制导致基础TNBC子集中的S相失速
图形键中的图标代码。图标表示平均值+/-SD。（A）“谷氨酰胺敏感性”癌（图2A中下划线）在无谷氨酰胺介质中的生长曲线。（B） 第3天无谷氨酰胺培养基中细胞的Annexin V反应性增加百分比。组平均值；A、 0.8%，+/-1.4；B 1.2%+/-1.4；C、 5.8%+/-3.2；t检验A与C p=0.005。（C） 使用细胞周期曲线拟合软件（FLOJO，Treestar），在对照（灰色）培养基和无谷氨酰胺（黄色）培养基中，表示第5天诺康唑治疗后G2/M（Δ%G2/M）细胞百分比的变化。（D） 对照（灰色）培养基与无谷氨酰胺（黄色）培养基中第5天培养物经诺卡唑治疗后S相分数百分比的成对条。（E） S期停滞伴随着总蛋白和丝氨酸780磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白的减少。（F） 培养融合降低了S相组分和谷氨酰胺敏感性；S相减少（Δ%），是指高密度文化（灰色图标）与低密度文化（彩色图标）的S相减少百分比；用虚线连接的成对图标代表一条单元格线。（G） 加倍时间（见图1C）与无谷氨酰胺培养基大小（见图2H）。另请参见图S3。
图4
图4。谷氨酰胺代谢的常见调节因子不能识别自养细胞
图形键中的图标代码；绿色方块，来自3 CD10的平均杂交信号+和3 BerEP4+纯化正常乳房样本。图标表示平均值+/-SD。（A）hGAC公司基因芯片杂交信号（log2)与编码为限制组B和C的无谷氨酰胺培养基大小（见图2H）相比，与其他培养基大小相比。（B）GLUL公司基因芯片杂交信号（log2)与第5天的无谷氨酰胺培养物大小（按分子亚型编码）相比，虚线将增殖、非肿瘤样本值括起来。（C）GLUL公司从NCBI GEO和Chin 2006下载的8个临床乳腺肿瘤表达数据集中，基底与腔或ER+与ER-样本的表达（Chin等人，2006）；配对箱线图下的t检验p值。（D） 无谷氨酰胺培养物大小与GLUL公司表达式如面板B中所示，但由限制组编码。（E，F）（E）的比较GLUL公司和（F）hGAC公司定量PCR分析显示，第3天谷氨酰胺充足与不足培养基中的mRNA水平；五十、 低密度；C、 汇合；Q、 谷氨酰胺。另请参见图S4和表S4、S5。
图5
图5。谷氨酰胺营养不良提供治疗机会
图标表示平均值+/-SD。（A）4个谷氨酰胺转运蛋白和普通重链的基因芯片杂交信号(SLC3A2型)谷氨酰胺营养不良细胞。（B） 从NCBI GEO和Chin 2006（Chin et al.，2006）下载的临床数据集的基底癌亚群的转运蛋白基因芯片杂交信号如图A所示，显示了一个示例数据集。（C） 相对天冬酰胺酶（y轴）和DON（x轴）敏感性（IC85)我们的细胞板，由限制组B和C与其他组编码；虚线，用于杀死敏感白血病细胞的天冬酰胺酶浓度在体外（1 u/ml）。（D） 第5天无谷氨酰胺培养物大小（来自图2A）与天冬氨酸酶敏感性（IC50如图所示）。（E） 四倍药物滴定和计算IC50C组营养缺陷型（M436）的样本。D类0，最高药物浓度和计算IC50数字键中的s；天冬氨酸、天冬酰胺酶；紫杉醇；多克斯，阿霉素。（F） TCA循环图，红色箭头表示谷氨酰胺的呼吸使用。数字表示质谱法测定每种代谢物所含的百分比（全部/几个/否）13从培养基中获得的碳13M436中的C-5-谷氨酰胺。（G） 谷氨酰胺限制的关键TCA循环代谢物池减少，以对照培养基的%表示；Q-，无谷氨酰胺培养基。（H） siRNA介导的增殖效应hGAC公司样本细胞系中的mRNA减少，以干扰siRNA转染的百分比表示。另请参见图S5，表S6，S7。
图6
图6。谷氨酰胺限制和xCT抑制增加ROS
图形键中的图标代码；NAC，N-乙酰胱氨酸；SASP、柳氮磺胺吡啶。图标表示平均值+/−SD。通过HPLC进行氨基酸定量。（A） 在对照培养基中培养24小时的细胞的培养基胱氨酸（xaxis）和谷氨酸（y轴）浓度的变化。（B） 24小时的谷氨酰胺限制或SASP治疗可减少C组营养不良者的胱氨酸/谷氨酸交换；胱氨酸；谷氨酸、谷氨酸。（C） 24小时谷氨酰胺限制或SASP治疗对C组TNBC中GSH含量的影响；Q-，无谷氨酰胺培养基；SASP，SASP在完全培养基中的治疗；SASP+2me，在β-巯基乙醇存在下进行SASP处理。（D） 通过DCFHDA荧光评估基底癌中的ROS水平，并将其标准化以控制介质反应性。浅蓝色，在无谷氨酰胺培养基中培养2天；组平均值；A、 112%+/-21；B、 121%+/-31；C、 162%+/-59；t检验组A与C的比较p=0.07；A组与B+C组p=0.074。浅灰色，无谷氨酰胺培养基+NAC。水鸭，用SASP处理24小时培养物；组平均值；A、 205%+/-43；B、 287%+/-62；C、 405%+/-168；t检验A组对C组p=0.019；A组与B+C组比较p=0.003。深灰色，SASP+NAC。（E） xCT功能相关基因的热图；红色，增加；绿色，减少；N、 纯化正常CD10+和BerEp4+乳腺上皮细胞；一、 增殖性非肿瘤细胞系；PE、ER+从胸腔积液中纯化的肿瘤细胞。（F）SLC7A11型基因芯片杂交信号（log2)与胱氨酸消耗量相比，图标按分子亚型编码。（G） 靶向48小时后M231的ROS水平SLC7A11型或在存在或不存在N-乙酰胱氨酸（NAC）的情况下，加扰siRNA。（H）SLC7A11型G部分中使用的siRNAs的敲除效率。参见图S6。
图7
图7。SASP抑制增殖体外和体内
图形键中的图标代码。图标表示平均值+/−SD。（A）根据HPLC分析（x轴）得出的完整介质中胱氨酸的消耗量与SASP敏感性（IC50). （B） NAC治疗可从每个限制组A-C中挽救SASP诱导的样本细胞培养尺寸缺陷。（C）SASP治疗可抑制异种移植物生长；组平均肿瘤体积分离p值如图所示。（D） 例人TNBC肿瘤标本中xCT的表达；细胞核，蓝色；xCT特异性HRP信号，棕色上部阳性，下部阴性。（E） SASP降低卡铂IC50大多数基础TNBC；用虚线连接的成对图标表示单个TNBC；彩色图标，卡铂IC50; 灰色图标，IC50卡铂加300µM SASP；Q插图。，与非致癌细胞相比，基础TNBC对谷氨酰胺的敏感性更低。（F） 讨论的谷氨酰胺分解代谢活性总结。红色，本手稿中测试的化合物；绿色，在谷氨酰胺类TNBC中具有潜在治疗抑制重要性的活性；深蓝色，LAT1谷氨酰胺/亮氨酸反转运蛋白和ASCT2，系统ASC谷氨酰胺转运蛋白；灰色，xCT，谷氨酸/胱氨酸反转运蛋白；浅蓝色，谷氨酰胺补充剂途径；SASP，柳氮磺吡啶；天门冬氨酸酶；DON，6-重氮-5-氧代-去甲亮氨酸；ATs、各种转氨酶；谷氨酰胺合成酶；谷氨酰胺酶；hGAC，谷氨酰胺酶的羧基末端剪接变体。并不是所有细胞内谷氨酰胺或DON靶点的使用都得到了说明。另请参见图S7。
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