Val66Met polymorphism of BDNF alters prodomain structure to induce neuronal growth cone retraction

doi:10.1038/ncomms3490

.2013:4:2490.

doi:10.1038/ncomms3490。

BDNF的Val66Met多态性改变前体结构诱导神经元生长锥回缩

阿古斯汀·阿纳斯塔西娅¹, 凯特琳·戴哈德, 摩西五世·赵, 内森·E·威尔, 克里蒂·伊尔马迪, 弗朗西斯·S·李, 芭芭拉·伦普斯特德, 克莱·布莱肯

附属公司

PMID： 24048383
预防性维修识别码： PMC3820160型
内政部： 10.1038/编码3490

BDNF的Val66Met多态性改变前结构域结构以诱导神经元生长锥回缩

阿古斯汀·阿纳斯塔西娅等。国家公社. 2013.

.2013:4:2490.

doi:10.1038/ncomms3490。

作者

阿古斯汀·阿纳斯塔西娅¹, 凯特琳·戴哈德, 摩西五世·赵, 内森·E·威尔, 克里蒂·伊尔马迪, 弗朗西斯·S·李, 芭芭拉·L·亨普斯特德, 克莱·布莱肯

附属

¹康奈尔大学威尔康奈尔医学院医学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065。

PMID： 24048383
预防性维修识别码： PMC3820160型
内政部： 10.1038/ncomms3490

勘误表in

国家公社。2014;5:3564

摘要

人类脑源性神经营养因子（BDNF）基因中常见的单核苷酸多态性（SNP）导致BDNF前体区的Val66Met替代。这种SNP与记忆力的改变以及人类患抑郁症和焦虑症的风险增加有关。在这里，我们发现在海马体中检测到分离的BDNF前体，并且它可以以活动依赖性的方式从神经元中分泌。利用核磁共振波谱和圆二色性，我们发现前体蛋白是内在无序的，Val66Met取代引起结构变化。令人惊讶的是，应用Met66（而非Val66）BDNF前体蛋白可诱导海马神经元急性生长锥回缩和Rac活性降低。这种效应需要p75（NTR）的表达和Met66前体蛋白与SorCS2受体的差异结合。这些结果确定Met66前体蛋白是一种新的活性配体，可调节神经元形态。

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数字

图1
在高水平检测到BDNF前体体内（a）SDS-PAGE后戊二醛固定转移膜后，从小鼠海马检测BDNF前体蛋白（15.5kDa）。（b）前驱体水平在年降低了一半*Bdnf公司^+/−*与野生型动物（WT）相比，小鼠海马溶解。（c）用N-聚糖酶（+Gly）处理海马裂解物可将前体蛋白的分子量降低至12.3kDa。（d） C57BL/6小鼠海马溶解物在胚胎第18天（E18）、出生后第0天和第5天（P0和P5）以及第1、2、3或9个月（M）的BDNF前体蛋白水平。（e）（d）的量化。条形代表归一化为β微管蛋白的前体细胞密度测定数据的平均值±标准偏差。每组n=3。（f）大鼠海马BDNF前结构域水平的比较*Bdnf公司^{有效/有效}*和*Bdnf公司^{已见/已见}*P0、P5、1和2月龄小鼠。（g）（f）的量化。条形代表归一化为β微管蛋白的前体细胞密度测定数据的平均值±标准偏差。n=每组4个。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。

图2
BDNF前体蛋白由培养的神经元分泌。（a）在第6天的介质中检测到前域*在体外*大鼠海马培养。用或不用α-2抗纤溶酶和/或MMP抑制剂II（MMP1、3、7和9抑制剂）处理培养物，以防止分泌型proBDNF的细胞外裂解。通过KCl去极化实现活性依赖性分泌。（b）（a）的量化。条形代表前驱体密度测定数据的平均值±标准偏差。n=每组3个。（c） N-聚糖酶处理降低了分泌的前体蛋白的分子量。（d）在第6天的介质中检测到前域*在体外*来自E18幼崽的海马皮层神经元*Bdnf公司^已见面/+*×*Bdnf公司^已见面/+*老鼠乱丢垃圾。分泌的前体蛋白水平在*Bdnf公司^{有效/有效}*和*Bdnf公司^{已见/已见}*文化。（e）（d）的量化。条形图表示前畴密度测量数据的平均值±s.e.m。每组n=4。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。

图3
Val66Met替代对BDNF前体蛋白结构的影响。（a） Val66（蓝色）和Met66（红色）前体蛋白上异核单量子相干（HSQC）光谱的叠加。每个交叉峰（化学位移）对应于前体蛋白序列中的一个残基（每个共价键对的一个化学位移¹H（H）-¹⁵前体序列中分配给特定酰胺的N个原子）。Val66和Met66前结构域的完整HSQC光谱可在补充图S5中获得。前体蛋白的主干化学位移存放在生物磁共振库中：Val66 ID编号：19358。Met66身份证号码：19357。（b） BDNF Val66和Met66前体蛋白之间的化学位移偏差（Δδ）表明，取代引起的变化局限于Val66Met取代位点附近的七个残基（E64、H65、I67、E68、E69、L70、L71）。显示窗口外残留量23-55和77-113的Δδ变化在0.007和0.0037 ppm之间。

图4
Val66和Met66前体蛋白在瞬态二级结构上有所不同。（a）使用主干获得的二级结构倾向（SSP）得分¹H、，¹⁵N、，¹³C化学位移来自BDNF前体Val66（蓝色条）和Met66（红色条）。SSP得分确定了瞬态结构形成的区域（正值=α-螺旋，负值=β-片）。（b）（c）利用Val66（b）和Met66（c）前体的异核主链化学位移，通过TALOS+分析进行二级结构预测的图表。蓝色球体中的α-螺旋，红色方块中的β-链，绿色三角形中的无序。TALOS+分析显示，与Val66前体蛋白相比，Met66前体基因的β-片状倾向降低，结果与SSP评分一致。（d）在10 mM NaH中收集的30μM Val66（蓝色）和Met66（红色）前体蛋白的紫外圆二色性（CD）光谱₂人事军官₄和50 mM NaCl，pH值7.0，温度为23°C。200 nm左右的负峰显示了两个前体蛋白的天然展开构象。然而，与Val66前体蛋白相比，Met66前体在222 nm处的低吸收与螺旋构象的增加趋势一致。每个频谱代表4次平均扫描，并仅归一化为缓冲区频谱。

图5
Met66前体蛋白诱导培养海马神经元的生长锥回缩。（a）用Val66或Met66前体蛋白（10 ng/ml）处理神经元20分钟，固定并染色肌动蛋白和p75^NTR公司箭头表示收缩的生长锥；星号表示完整的生长锥。比例尺：20μm。（b） p75中生长锥回缩的量化^NTR公司（a）中显示的阳性细胞，与p75相比^NTR公司阴性细胞。Prodomain缩写为prod.（b）n=4个独立实验。条形代表平均值±标准误差。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。

图6
Val66和Met66前体蛋白与SorCS2的结合方式不同，但不与p75结合^NTR公司（a，b）用指示的构建体转染HEK293T细胞，用抗HA抗体免疫沉淀裂解物，然后用指示的抗体检测。V=Val66前体蛋白和M=Met66前体结构。（a）我们无法检测到两种前体蛋白与p75的相互作用^NTR公司联合免疫沉淀法。4个独立实验的代表性印迹。（b） Val66和Met66前体蛋白均与SorCS2共同免疫沉淀，但Met66前体内的相互作用比（c）中定量的Val66多23%。（c） n=9个独立实验。条形代表平均值±标准误差。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。Val66和Met66前体蛋白与SorCS2（d）或p75的相互作用^NTR公司（e）也通过核磁共振波谱进行了评估。Δδ=Val66和Met66前体蛋白以及受体之间的化学位移偏差。在4.5μM下评估前体蛋白与SorCS2（d）的相互作用，并在600 MHz下收集数据。与Val66前体蛋白相比，Met66前体在残基65和71（如#所示）与SorCS2相互作用时显示出更大的化学位移变化。前体蛋白与p75的相互作用^NTR公司（e）在6.6μM下评估两种蛋白质，并在800 MHz下收集数据。前体蛋白与p75的相互作用^NTR公司核磁共振检测不到。计算所有分析的标准偏差（s.d.），并绘制相当于2 s.d.的阈值线，以显示所认为的相互作用的极限。

图7
需要Met66-SorCS2相互作用来诱导生长锥回缩。（a） SorCS2抗体能够阻止Met66前体蛋白诱导的生长锥回缩。用抗SorCS2（或对照IgG）预先培养神经元，用Val66或Met66前体蛋白（10 ng/ml）处理20分钟，然后进行生长锥回缩分析。p75中评估的量化^NTR公司来自3个独立实验的阳性细胞。（b）代表性印迹显示在使用SorCS2-shRNA（sh-SorCS2）慢病毒感染敲除后，与未感染的对照或scramble shRNA（sh-Scr）感染的细胞相比，培养的海马神经元中SorCS2的表达。（c） SorCS2 shRNA实现的SorCS1部分下调能够部分阻止Met66前体蛋白诱导的生长锥回缩。量化4个独立实验。（d）只有Met66前体蛋白给药，而不是Val66，会导致培养海马神经元Rac活性降低。海马神经元与Val66或Met66前体蛋白孵育20分钟，细胞裂解物与GST-PAK-CRIB珠孵育以分离激活的Rac（Rac-GTP）。（e）（d）的量化。活性Rac通过密度计测量，并归一化为输入中的总Rac。在4个独立实验中评估量化。条形代表平均值±标准误差。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。

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