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.2013年8月30日；8（8）：e73944。
doi:10.1371/journal.pone.0073944。 2013年电子收集。

分子伴侣介导的SOD1（G93A）小鼠肌萎缩侧索硬化模型的晚期神经保护

谢尔盖·诺沃塞洛夫 1, Wendy J芥末, 安娜·L·格雷, 詹姆斯·迪克, 纳希德·卡努加, 伯纳黛特·卡尔玛, 琳达·格林史密斯, 迈克尔·E·契特姆
附属机构

分子伴侣介导的SOD1（G93A）小鼠肌萎缩侧索硬化模型的晚期神经保护

谢尔盖·诺沃塞洛夫等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是脊髓、脑干和运动皮层中的运动神经元选择性丢失。超氧化物歧化酶（SOD1）突变与家族性ALS相关，并导致SOD1蛋白错误折叠和聚集。在这里，我们表明导致远端遗传性运动神经病的分子伴侣HSJ1（DNAJB2）突变可以减少突变SOD1聚集，并提高ALS突变SOD2模型中运动神经元的存活率。体内SOD1（G93A）转基因小鼠运动神经元中人HSJ1a（hHSJ1a）的过度表达可改善疾病。特别是，肌肉力量显著改善，运动单位数量增加，运动神经元存活率提高。hHSJ1a存在于与SOD1（G93A）的复合物中，导致疾病进展后期SOD1聚集减少。我们还观察到双转基因动物的泛素免疫反应发生改变，表明泛素修饰可能对观察到的改善很重要。在SOD1（G93A）聚集的细胞模型中，HSJ1a优先与突变SOD1结合，增强SOD1泛素化，并以J域和泛素相互作用基序（UIM）依赖方式减少SOD1聚集。总的来说，数据表明HSJ1a通过伴侣、共伴侣和前泛素化活性的组合作用于突变体SOD1。这些结果表明，体内靶向SOD1蛋白的错误折叠和聚集可以起到神经保护作用，并提示操纵DnaJ分子伴侣可能有助于ALS的治疗。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。hHSJ1a在脊髓中的表达。
(A类)代表性的Western blot显示使用抗HSJ1抗体（S653）在60、90和120天龄的G93A和DBLE转基因动物中HSJ1表达的总水平。注意，人类HSJ1a（hHSJ1a）转基因带正好位于内源性小鼠HSJ1a的上方（mHSJ1a，小鼠HSJ1b）的下方。(B类)用密度计分析脊髓中的hHSJ1a水平，并将其归一化为mHSJ1a（左侧）或mHSJ1b（右侧）。绘制各年龄组的平均相对表达±SEM（n≥4；*p<0.05）。(C类)120天龄WT、hHSJ1a、G93A和DBLE转基因小鼠脊髓胸椎区抗HSJ1a（16321）免疫组织化学的代表性图像证实了运动神经元中hHSJ1b的表达。比例尺：20µm。
图2
图2。hHSJ1a不影响SOD1的体重G93A公司老鼠。
(A类)女性和(B类)雄性WT、（白线）hHSJ1a（灰点）、G93A（灰线）或DBLE（黑点）小鼠从70–120天龄开始每周至少称重两次。显示了平均体重±SEM（n≥7）。
图3
图3。hHSJ1a表达改善SOD1的肌肉特性G93A公司老鼠。
雌性小鼠在120±5天时进行评估。(A类)胫骨前肌（TA）产生的最大强直力（n≥8）。(B类)指长伸肌（EDL）产生的最大强直力（n≥10）。(C类)G93A动物TA肌肉的峰值时间（TTP）力增加(D类)EDL：在DBLE中，TTP的增加部分减少（n≥10）。(E类)TA和(如果)EDL肌肉（n=12）。所有图表均显示平均值±SEM，（***p<0.001**p<0.01，*p<0.05）。
图4
图4。hHSJ1a的表达提高了SOD1中运动单位和运动神经元的存活率G93A公司老鼠。
(A类)WT、hHSJ1a、G93A和DBLE雌性小鼠的EDL肌肉显示了运动单位痕迹的典型示例。(B类)EDL肌肉±SEM中的平均运动单位如条形图所示（n≥10；***p<0.001，*p<0.05）。(C类)120天WT、hHSJ1a、G93A和DBLE雌性小鼠腰椎脊髓切片的典型组织学染色。切片用绞股蓝染色。插图显示了方框区域的放大倍数。比例尺200µm。(D类)在光镜下分析120天脊髓L2–L6区的连续gallocynanin染色切片，并计数运动神经元。条形图显示了平均运动神经元数±SEM（n=3***p<0.001，**p<0.01）。
图5
图5。hHSJ1a的表达不能提高运动神经元90天的存活率或SOD1的寿命G93A公司老鼠。
(A类)在光学显微镜下分析了90天龄雌性小鼠脊髓L2–L6区的连续gallocynanin染色切片，并对运动神经元进行了计数。条形图显示了平均运动神经元数±SEM（n=3*p<0.05）。(B类)显示雄性G93A和DBLE小鼠的平均存活率（n≥11）。hHSJ1a的过度表达对SOD1的寿命没有影响G93A公司老鼠。
图6
图6。hHSJ1a降低脊髓中聚集的SOD1水平。
(A类)来自指定年龄雄性转基因动物脊髓裂解物的具有代表性的抗SOD1（C4F6）蛋白印迹在还原条件下得到解决。通过密度测定法对突变SOD1水平进行量化，相对于β-微管蛋白进行表达，并将每组至少四条独立脊髓的G93A（浅灰色）和DBLE（黑色）条数据绘制为平均值±SEM。(B类)通过SDS-PAGE在非还原条件下解析具有抗SOD1（C4F6）抗体的指定年龄雄性小鼠脊髓裂解物的代表性蛋白质印迹。注意DBLE脊髓中SOD1的高分子量（HMW）低聚物的减少。左侧以kDa表示的分子量标记的位置(C类)通过还原G93A和DBLE转基因雄性动物的SDS-PAGE，对不同年龄段的总SOD1、可溶性SOD1和不溶性SOD1进行差异沉淀后的代表性Western blot分析表明，抗SOD1（C4F6）染色证实了洗涤剂不溶性的SOD1随年龄增长而增加，而hHSJ1a的过度表达可减少这种增加。使用密度计根据至少四根独立的脊髓测量颗粒洗涤剂不溶性SOD1的水平，并绘制G93A（浅灰色）和DBLE（黑色）棒的平均值±SEM图，用于每个年龄组（n≥4；*p<0.05）。(D类)hHSJ1a与DBLE转基因雄性动物脊髓中的SOD1相关。免疫沉淀物质（IP）的免疫印迹检测HSJ1和SOD1。如图所示，在120天龄时，使用WT、hHSJ1a、G93A和DBLE转基因脊髓裂解物进行IP，并使用抗HSJ1（S653）、SOD1（C4F6）或对照抗体（IgG）。星号表示所用抗体组合的特征性非特异性条带。
图7
图7。hHSJ1a改变SOD1中的泛素化G93A公司脊髓。
(A类)用SEDI抗SOD1抗体对雌性小鼠120天的腰椎进行免疫组化，WT组织无反应性，G93A和DBLE呈点状染色。标尺50µm(B类)如图所示，雌性小鼠G93A或DBLE 90天脊髓的免疫荧光显示，运动神经元细胞体和βIII微管蛋白抗体标记的突起中的泛素染色增强（绿色）。用MERGE面板中可见的DAPI对细胞核进行染色。比例尺20µm。
图8
图8。HSJ1a减少SK-N-SH细胞中包涵体的形成。
(A类)野生型（SOD1-WT）或SOD1的代表性图像G93A公司在没有或存在HSJ1a的情况下，转染细胞中的突变GFP-SOD1（SOD1-G93A）定位。比例尺：10µm。(B类)在三个独立的实验中，通过计算每个转染条件下400多个细胞来确定包涵体阳性细胞的发生率。各组的平均值±SEM图（*p<0.05，***p<0.001）。(C类)在存在或不存在HSJ1a、HSJ1a J结构域突变体（H31Q）或UIM突变体（ΔUIM）的情况下，使用来自总细胞裂解物（total）的SOD1 WT或G93A的抗SOD1（SOD-100）与差异沉淀后的可溶部分（可溶）或沉淀不溶部分（不可溶）进行比较的典型Western blot。(D类)带有抗SOD1（SOD-100）或抗HSJ1（S653）的蛋白质印迹显示SOD1的相互协同免疫沉淀（IP）（抗GFP）或抗-HSJ1a（抗myc）。与SOD1-WT相比，HSJ1a与SOD1-G93A的回收率更高。与对照非特异性抗体（IgG）没有共沉淀。
图9
图9。hHSJ1a增强SOD1G93A型泛素化。
(A类)代表性免疫荧光图像显示，与MG132共转染和蛋白酶体抑制后，突变GFP-SOD1（SOD1-G93A，绿色）、myc-HSJ1a（S653，红色）和myc-ubiquitin（pan-Ub，蓝色）在SK-N-SH细胞的细胞内包涵体（箭头所示）内共同定位。比例尺：10µm。(B类)用所示抗SOD1（C4F6或SOD100）、抗HSJ1（S653）和泛素（Ub）抗体进行免疫印迹，显示所示转染SK-N-SH细胞并用MG132处理的输入和C4F6免疫沉淀物质。蛋白酶体抑制后，观察到WT HSJ1a存在时泛素反应性增加。HSJ1a H31Q突变没有刺激泛素化SOD1的蛋白酶体降解，而HSJ1aΔUIM突变没有刺激SOD1-G93A泛素化。星号表示IgG带。分子量标记的位置显示在左侧。
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