Autophagy sustains mitochondrial glutamine metabolism and growth of BrafV600E-driven lung tumors

doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0397

.2013年11月；3（11）：1272-85。

doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0397。 Epub 2013年8月21日。

自噬维持BrafV600E驱动的肺肿瘤的线粒体谷氨酰胺代谢和生长

安妮·斯特罗赫克（Anne M Strohecker）¹, 杰西·燕翔（Jessie Yanxiang Guo）, Gizem Karsli-Uzunbas公司, 桑迪·M·普莱斯, 光华Jim Chen, 罗宾·马修, 马丁·麦克马洪, 艾琳·怀特

附属公司

附属

¹1新泽西州癌症研究所，新不伦瑞克；2新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系；加州大学旧金山分校海伦·迪勒家族综合癌症中心细胞与分子药理学系。

PMID： 23965987
预防性维修识别码：项目经理3823822
内政部： 10.1158/2159-8290.CD-13-0397

自噬维持线粒体谷氨酰胺代谢和BrafV600E驱动的肺肿瘤的生长

安妮·斯特罗赫克（Anne M Strohecker）等人。癌症发现. 2013年11月.

.2013年11月；3(11):1272-85.

doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0397。 Epub 2013年8月21日。

作者

附属

¹1新泽西州癌症研究所，新不伦瑞克；2新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学分子生物学和生物化学系；加州大学旧金山分校海伦·迪勒家族综合癌症中心细胞与分子药理学系。

PMID： 23965987
预防性维修识别码：项目经理3823822
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摘要

缺陷线粒体的自噬清除可抑制氧化应激并保护线粒体功能。在此，在存在或不存在肿瘤抑制因子Trp53的情况下，在BrafV600E诱导的肺癌的小鼠模型中，必需的自噬基因Atg7被删除。Atg7缺失最初诱导氧化应激并加速肿瘤细胞增殖，与Nrf2消融术无明显区别。Atg7和Nrf2的复合缺失没有加性效应，表明这两个基因通过调节氧化应激调节肿瘤发生，揭示了自噬介导的肿瘤抑制的潜在机制。在肿瘤发生的后期，Atg7缺乏导致缺陷线粒体的积聚、增殖缺陷、肿瘤负担减轻、腺瘤和腺癌转化为嗜酸细胞瘤，并延长小鼠寿命。自噬缺陷肿瘤衍生细胞系的呼吸能力和饥饿生存能力受损，并具有谷氨酰胺依赖性，表明蛋白质降解产生的自噬底物维持BrafV600E肿瘤的生长和代谢。

意义：重要的自噬基因Atg7通过保护线粒体谷氨酰胺代谢促进BrafV600E驱动的肺肿瘤发生。这表明抑制自噬是治疗BrafV600E驱动癌症的一种新方法。

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利益冲突声明

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数字

**图1。*附件7*小鼠模型中的缺失阻断自噬*吹牛^V600E版本*–驱动肺部肿瘤发生**
A.ATG7和表面活性剂蛋白C在7的代表性IHC(*布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*)创建后。显示了这些数据的量化。图S1提供了晚期时间点（20、30周）ATG7表达的IHC。比例尺=10μm B。LC3-I到LC3-II转化的Western blot分析，以及在*布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*和*布拉夫^{V600E版本/+}; 附件7^−/−*Cre后10周肿瘤裂解物。数字指的是单个老鼠。在正常肺和肿瘤裂解物之间故意包括一条空白通道。另一个*附件7*出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。C.LC3斑点的代表性IHC染色*布拉夫^{V600E版本/+}; 附件7^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*肿瘤感染后8周。比例尺=10μm。箭头表示点。请注意，在*附件7*无肿瘤。

**图2。*附件7*缺乏对肿瘤的形成和维持有明显的影响*布拉夫^V600E型*–驱动性肺肿瘤，与嗜酸细胞瘤的出现和线粒体功能衰竭有关**
A.Cre后指定时间肺叶的典型H&E染色。比例尺=3mm。全日制课程的H&E扫描幻灯片如图S2所示。B.通过Matlab在指定的时间点通过H&E幻灯片量化肿瘤负担（两只小鼠/组，分析所有肺叶）。误差线表示SEM。全日制课程的H&E扫描幻灯片如图S2所示。C.Cre后5、7、14周H&E幻灯片的代表性低倍图像。比例尺=100μm。插图中提供了更高放大率的图像。比例尺=50μm。D.指定时间内肿瘤H&E染色的代表性高倍图像。请注意*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*表明嗜酸细胞瘤的肿瘤。比例尺=10μm E。*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*肿瘤有缺陷线粒体堆积。Tom20 IHC的代表性图像、电子显微照片和Cre后指定时间的酶细胞色素c氧化酶分析。对于Tom20，比例尺=10μm。对于EM，N=细胞核MT=线粒体。比例尺=500 nm。箭头指向肿胀的线粒体*布拉夫^{V600E版本/+}; 附件7^−/−*肿瘤。对于细胞色素c氧化酶，箭头指向用虚线表示的肿瘤区域，其中线粒体缺陷位于*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*肿瘤。比例尺=100μm。F.肿瘤裂解物中Cox-IV的Western blot布拉夫^V600E/+；附件7^+/+和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后10周的小鼠。数字指的是单个老鼠。在正常肺和肿瘤裂解物之间故意包括一条空白通道。另一个*附件7*出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。G.Kaplan-Meier分析*布拉夫^V600E/+；附件7^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*小鼠接种Cre。显示了每组动物的数量和平均存活率。H.Kaplan-Meier分析*布拉夫^V600E/+；贝克林1^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 贝克林1^+/−*小鼠接种Cre。显示了每组动物的数量和平均存活率。I.Ki67、p53和p21的代表性IHC来自*布拉夫^V600E/+；附件7^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后14周的小鼠。比例尺=10μm。Cre后5、7、14周IHC的量化如下所示。整个时间过程的图像如图S4所示。

**图3。p53缺失并不能消除携带*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*肿瘤**
A.ATG7表达、LC3-I到LC3-II的转化以及p62在肿瘤裂解物中的积累的Western blot分析*Trp53基因^+/+; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*,*Trp53基因^+/+; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*和*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*,*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后14周。数字指的是单个老鼠。B.代表性的显微CT图像和3D重建*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*和*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后3周和5周的肿瘤显示*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*小鼠在早期的时间点。数字指的是单个老鼠。右侧显示了正常肺容量的量化。C.典型的显微CT图像和3D重建*Trp53基因^+/+; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*,*Trp53基因^+/+; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*和*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*,*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后7周和10周的肿瘤显示*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*在晚时间点的老鼠。数字指的是单个老鼠。右侧显示了正常肺容量的量化。D.Ki67染色的代表性图像*Trp53基因^+/+; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+，Trp53^+/+; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*和*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*,*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后4周和14周肿瘤。比例尺=10μm量化显示在右侧。E.Kaplan-Meier分析*Trp53基因^+/+和Trp53^−/−*;*布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*小鼠接种Cre。每组小鼠的数量和平均存活率如图所示。注：当p值高度显著（p=0.0003）时，本研究于22周结束。F.组织学（H&E）、Tom20 IHC、电子显微镜和Cre后指定时间的酶细胞色素c氧化酶分析的代表性图像。对于H&E，比例尺=10μm对于Tom20，比例栏=2μm。对于EM，N=细胞核MT=线粒体。比例尺=500 nm。箭头指向肿胀的线粒体*Trp53基因^−/−; 布拉夫^{V600E版本/+}; 附件7^−/−*肿瘤。对于细胞色素c氧化酶，箭头指向用虚线表示的肿瘤区域，其中线粒体缺陷位于*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*肿瘤。比例尺=100μm

**图4。损失*编号2*表型模拟*附件7*与寿命延长有关**
A.肺肿瘤中p62和NRF2的代表性IHC染色*布拉夫^V600E/+；附件7^+/+*和*布拉夫^V600E/+；附件7^−/−*Cre后指定时间的小鼠。比例尺=10μm。量化如下所示。误差条为SEM.B.肿瘤裂解物中NRF2积累的Western blot分析*布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*和*布拉夫^V600E型/+; 附件7^−/−*Cre后10周的小鼠。数字是指个体动物。在正常肺和肿瘤裂解物之间故意包括一条空白通道。另一个*附件7*出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。单肺叶的H&E染色显示肿瘤的大小和数量急剧增加*编号2^−/−*Cre后4周，小鼠无自噬状态。比例尺=3 mm。右侧显示肿瘤负担的量化。这个*编号2^+/+*和*编号2^−/−*graph是自噬活性和缺陷braf肿瘤的集合。这些数据在下一个图表中单独绘制。两组患者的肿瘤负担差异*编号2^−/−;布拉夫^V600E/+；附件7^+/+*和*编号2^−/−;布拉夫^V600E/+；附件7^−/−*小鼠无统计学意义（p=0.63）。两组患者的肿瘤负担差异*编号2^+/+;布拉夫^{V600E/+版本；}附件7^+/+*和*编号2^+/+;布拉夫^V600E/+；附件7^−/−*小鼠在本实验中没有统计学意义（p=0.49）。请参考图2A-C、S3和3B中的类似实验。D.Cre后4周的γ-H2AX的H&E和IHC分析的代表性图像。比例尺=10μm E。Cre后17周8-oxo-dG的IHC代表性图像。比例尺=10μm F.Kaplan-Meier分析*Nrf2；布拉夫；附件7*复合突变小鼠。显示每组小鼠的数量和平均存活率。请注意*编号2^−/−;布拉夫^V600E/+；附件7^+/+*和*编号2^+/+;布拉夫^V600E/+；附件7^+/+*小鼠只是错过了统计学意义（p=0.06）。

**图5。Atg7缺失会在饥饿期间损害线粒体代谢和存活**
A.在Cre后9周分离的TDCL中ATG7表达的Western blot分析*Trp53基因^−/−;布拉夫^V600E型/+; 附件7^+/+*或*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E/+；附件7^−/−*老鼠。数字是指单个克隆。另一个*附件7*出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。B.在3天HBSS饥饿时间过程中LC3-I转化为LC3-II的Western blot分析。数字指的是单个克隆。显示了两对ATG7野生型和ATG7空派生TDCL。C.在HBSS饥饿3天和在正常生长介质中恢复4天后，对自噬活性或缺陷TDCL进行克隆形成分析。D.同种异体移植生长*Trp53基因^−/−; 布拉夫^V600E/+；附件7^−/−*和*Trp53基因^−/−; 布拉夫^{V600E/+版本；}附件7^+/+*TDCL。对每个基因型的8个肿瘤进行监测。E.TDCL总线粒体质量和相对线粒体膜电位（MMP）的FACS分析。F.海马测量正常生长条件下或4小时HBSS饥饿后自噬能力强和缺乏TDCL的基础和储备耗氧率（OCR）。G.在正常生长培养基中，在3天的HBSS饥饿和4天的恢复期间，用补充外源性谷氨酰胺（2mM）、丙酮酸钠（1mM）或葡萄糖（4.5g/L）的RPMI、HBSS或HBSS培养的TDCL的克隆形成存活率。H.添加2mM谷氨酰胺（Q）前后，用HBSS孵育的TDCL中OCR的海马测量。喷油正时由箭头指示。

**图6。的角色*附件7*在*布拉夫^V600E型*-驱动性肺肿瘤**
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中的注释

自噬在BrafV600E驱动的肺癌小鼠模型中的致瘤和抑制作用。
陈S，关JL。 Chen S等。癌症发现。2013年11月；3(11):1225-7. doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0664。癌症发现。2013 PMID：24203955 免费PMC文章。

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[5] Takamura A、Komatsu M、Hara T、Sakamoto A、Kishi C、Waguri S等。自噬缺陷小鼠会发生多发性肝肿瘤。基因与发育。2011;25:795–800。-项目管理咨询公司-公共医学

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[8] Yue Z、Jin S、Yang C、Levine AJ、Heintz N.Beclin 1是早期胚胎发育所必需的自噬基因，是一种单倍体抑癌基因。美国国家科学院院刊，2003年；100:15077–82.-项目管理咨询公司-公共医学

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